O Sequenciamento genômico
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- Pedro Lucas Márcio Tuschinski Castel-Branco
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1 Pontifícia Universidade atólica de oiás Departamento de Biologia Disciplina: Bioinformática Bio1015 Prof. Macks Wendhell onçalves, Msc O Sequenciamento genômico
2 Sequenciamento genômico O sequenciamento genômico é uma técnica que permite identificar, na ordem correta, a sequência de nucleotídeos de uma molécula de DN ou RN. O sequenciamento de DN, seguido da montagem genômica, permite obter informações sobre: - Estrutura e função dos genes - Diversidade genética - Presença de elementos móveis no genoma - Presença de genes adquiridos por transferência lateral - Relações evolutivas - onstrução de mapas metabólicos
3 Sequenciamento genômico O que o sequenciamento de DN genômico não é capaz de responder? - Quais genes estão sendo expressos no momento do ensaio - Qual o nível da expressão estes genes se encontram Para se obter essas informações é necessário o sequenciamento do RN (cdn) por meio de técnicas de RN-Seq. Desta forma é possível responder: - Se determinado gene é importante a uma situação específica - Se o gene sofre algum tipo de regulação da expressão a nível transcricional - Este é o caso dos experimentos com ESs e ORESES
4 Métodos de sequenciamento Sequenciamento de 1º eração - Degradação química Maxam & ilbert - Interrupção da cadeia (ddnps) Sanger Sequenciamento de 2º eração Roche - Illumina HiSeq, MiSeq Sequenciamento de 3º eração - Ion orrent BI - Life echnologies - Nanopore ridion / MiniIon - PacBio RS Pacific Biosciences
5 Sequenciamento do DN: 1 a geração Baseado em hidrólise química da molécula de DN Sequenciamento enzimático dideóxi término de cadeia
6 Sequenciamento do DN: Maxam-ilbert técnica desenvolvida por eles utiliza marcação do DN alvo a ser sequenciado com fósforo radioativo (P 32 ). O P 32 é ligado a um dp formando um P 32 -dp. Essa molécula é incorporada ao DN molde (extremidades 5 ou 3 ) pela enzima polinucleotídeo kinase. Neste método, o rompimento das pontes de hidrogênio da fita dupla de DN ocorre pela adição de dimetil sulfato e aquecimento a 90º.
7 Sequenciamento do DN: Maxam-ilbert pós a desnaturação, o DN molde marcado com P32 é clivado em 4 regiões (antes do, /, / e s). Para identificar o nucleotídeo aplica-se o produto dessa reação em 4 canaletas do gel. B Representação esquemática evidenciando o último nucleotídeo de cada um dos fragmentos (diferentes tamanhos) do gel de poliacrilamida. Sequências de nucleotídeos do DN sequenciado.
8 Sequenciamento do DN: Maxam-ilbert
9 Sequenciamento DN: Sanger 1975: Propôs melhorias significativas do método de Maxam-ilbert. Inventou o método dideóxi para o sequenciamento do DN 1977: sequencia, pela primeira vez, o genoma inteiro de um organismo, o bacteriófago phi X genes em bases sequenciadas à mão - anha o segundo Nobel de química em
10 Sequenciamento DN: Sanger ssim como a metodologia de Maxam-ilbert, a técnica desenvolvida por Sanger também utiliza marcação radioativa. - diferença é que a primeira marcava diretamente o DN molde. Já a de Sanger marca fragmentos de DN sintetizados a partir de uma fita molde. síntese desses fragmentos a partir de um DN molde foi possível graças a PR. Por fim, é necessário ainda a presença de didesoxinucleotídeos (ddp, ddp, ddp e ddp), que atuam como terminadores da síntese de DN.
11 Sequenciamento DN: Sanger Diferença do desóxinucleotídeo com o didesóxinucleotídeo. s chances de a DN polimerase reconhecer essas duas moléculas é a mesma. Desóxinucleotídeo Didesóxinucleotídeo O que faria um nucleotídeo que, ao invés da extremidade 3 OH, tivesse uma extremidade 3 H???
12 Sequenciamento DN: Sanger Sanger incorporou reagentes tipicos de uma PR com a adição dos respectivos dideóxi (ddnp) em tubos separados. cada ciclo de PR um novo fragmento de DN é formado dependendo do dnp e ddnp incorporado. B Representação esquemática evidenciando o último nucleotídeo de cada um dos fragmentos de diferentes tamanhos do gel de Poliacrilamida.
13 Sequenciamento DN: Sanger DN molde DN polimerase ampão dnps ddps ddps ddps ddps
14 Sequenciamento DN: Sanger
15 Sequenciamento DN: Sanger
16 3 5 3 Sequenciamento DN: Sanger
17 Sequenciamento DN: Sanger
18 Sequenciamento DN: Sanger
19 Sequenciamento DN: Sanger
20 Sequenciamento DN: Sanger
21 Sequenciamento DN: Sanger
22 Sequenciamento DN: Sanger Sanger e o fago Phi 174 De fato, esse tipo de sequenciamento manual continuou acontecendo por décadas...
23 Sequenciamento DN: Sanger Desvantagem
24 Sequenciamento DN: Método Semiautomático partir do aprimoramento do sequenciamento de Sanger surgiu o método de sequenciamento semiautomático. principal modificação foi, no lugar de compostos radioativos, adicionar aos didesoxinucleotídeos corantes capazes de emitir fluorescência quando excitados em comprimento de onda específico. omo os dideóxi passaram a ser marcados com fluoróforos, agora as 4 reações passaram a poder ocorrer no mesmo tubo, aumentando 4x a velocidade do ensaio. BI 3730xl
25 Sequenciamento DN: utomatizado Nos métodos automatizados os géis de difícil manuseio foram substituídos por finíssimos capilares preenchidos com gel onde os fragmentos de DN são separados em altíssima velocidade. pós a eletroinjeção os fragmentos começam a migrar até passarem por um feixe de laser que excita os fluoróforos em cada dnp fazendo com que esses emitam uma fluorescência característica de cada nucleotídeo. Um detector registra esta fluorescência e a transmite para um computador que possui um software capaz de converter fluorescência em picos coloridos, reconhecendo os 4 nucleotídeos.
26 Sequenciamento DN: utomatizado
27 Sequenciamento DN: utomatizado
28 Sequenciamento DN: utomatizado Modelos de sequenciadores automáticos que fazem uso da técnica de Sanger.
29 Sequenciamento DN: Shotgun O genoma humano foi sequenciado utilizando essa metodologia de sequenciamento.
30 Sequenciamento de Nova eração: 2º geração pós a publicação do rascunho do genoma humano, houve um avanço nas tecnologias de sequenciamento culminando no surgimento dos sequenciadores de segunda geração. Principais plataformas: - Plataforma 454 (Roche) - Plataforma Illumina - Plataforma SOLID
31 Sequenciamento de 2º geração: Plataforma 454
32 Sequenciamento de 2º geração: pós a divulgação do sequenciamento do genoma humano surge os sequenciadores de 2º geração reduzindo significativamente os custos.
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