Princípios e Aplicações da Técnica de PCR

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1 Universidade Federal de Santa Catarina Centro de Ciências Biológicas XVIII Semana Acadêmica da Biologia- UFSC Curso teórico-prático Princípios e Aplicações da Técnica de PCR Prof. Dr. Rafael D Rosa Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Genética Laboratório de Imunologia Aplicada à Aquicultura rafael.d.rosa@ufsc.br

2 Princípios e Aplicações da Técnica de PCR Carga horária: 10 h/a Coordenador: Prof. Dr. Rafael Diego da Rosa Ministrantes: Cairé Barreto (PPGBTC-UFSC) Gabriel M Matos (PPGBTC-UFSC) Natanael D Farias (PPGBCD-UFSC) Nicolas A Conceição (Biologia-UFSC) Período: 18 a 21 de setembro de 2017 (segunda à quinta) Horário: 19h30 às 22h00 Local: Laboratório Morfofuncional do CCB

3 Princípios e Aplicações da Técnica de PCR DIA AULA ASSUNTO 18 Teórica Apresentação do curso Estrutura de ácidos nucleicos e Replicação do DNA A Reação em Cadeia da Polimerase(PCR) 19 Teórica Eletroforesedeácidosnucleicos Escolha de iniciadores de PCR Teórica Preparo de amostras e otimização de reações de PCR Prática Reações de PCR convencional Teórica Variações da técnica de PCR Prática Eletroforese de DNA

4 Princípios e Aplicações da Técnica de PCR

5 Princípios e Aplicações da Técnica de PCR Bibliografia

6 PCR Reação em Cadeia da Polimerase

7 A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) PCR: POLYMERASE CHAIN REACTION AREAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

8 A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Amplificação in vitro de sequências ESPECÍFICAS de DNA

9 ESTRUTURA E REPLICAÇÃO DO DNA

10 Estruturados ácidos nucleicos DNA Ácido DesoxirriboNucleico RNA Ácido RiboNucleico

11 Estruturados ácidos nucleicos Polímeros lineares de nucleotídeos GRUPO FOSFATO BASE NITROGENADA PENTOSE

12 Estruturados ácidos nucleicos DNA ou ADN: Ácido DesoxirriboNucleico Polímeros de desoxinucleotídeos (da, dt, dce dg) Normalmente em fita dupla (dsdna) Fitas complementares (em direções opostas)

13 Estruturados ácidos nucleicos

14 Estruturados ácidos nucleicos Desnaturação e Renaturação do DNA

15 Estruturados ácidos nucleicos Desnaturação e Renaturação do DNA FORTE ligações fosfodiéster (mesma fita) FRACA pontes de H (entre as fitas)

16 Estruturados ácidos nucleicos Desnaturação e Renaturação do DNA

17 Estruturados ácidos nucleicos Desnaturação e Renaturação do DNA

18 Estruturados ácidos nucleicos Desnaturação e Renaturação do DNA

19 Replicaçãodo DNA A replicação do DNA ocorre de forma semiconservativa

20 Replicaçãodo DNA Polimerização unidirecional: sentido 5 3

21 PCR Fundamentos da Técnica

22 Fundamentosda PCR Estrutura dos ácidos nucleicos Replicação do DNA Conceito da técnica de PCR Fundamentos da técnica de PCR Aplicações da PCR Como visualizar e interpretar os resultados Quais as variações da técnica de PCR Como preparar reações de PCR PCR na prática!

23 Fundamentosda PCR A Reação em Cadeia da Polimerase Polimerização in vitro do DNA - Apenas moléculas de DNA (RNA e proteínas) - Enzima DNA polimerase - Amplificação de sequências específicas Reação em Cadeia : reação cíclica -Produtos de um ciclo são substrato para o ciclo seguinte

24 Fundamentosda PCR PCR Reação enzimática baseada na Replicação

25 Fundamentosda PCR TEMPERATURA

26 Fundamentosda PCR Os iniciadores de PCR A Enzima DNA polimerase não se liga em fita simples Iniciadores ou oligonucleotídeos(=primers) Utilização de pares de inciadores(um complementar para cada fita) Iniciador Senso (Forward): se liga na fita 3-5 Iniciador Antissenso (Reverse): se liga na fita 5-3

27 Fundamentosda PCR 25 C tubulina actina miosina 95 C 60 C 72 C

28 Fundamentosda PCR Reação Cíclica Desnaturação Extensão Várias vezes... Hibridização

29 Fundamentosda PCR

30 Fundamentosda PCR até bilhões de cópias!

31 Fundamentosda PCR Visualização dos produtos em géis (eletroforese) A cada ciclo, o número de cópias aumenta Número de ciclos

32 Fundamentosda PCR Componentes de uma reação de PCR: Amostra de DNA dntps(datp, dttp, dctp, dgtp) Iniciadores (S e AS) Enzima DNA Polimerase Tampão da enzima Mg 2+ (MgCl 2 ou MgSO 4 )

33 Fundamentosda PCR Mg 2+ TAMPÃO

34 Fundamentosda PCR As principais etapas: Desnaturação (90-96 C) DNA Polimerase (termoestável) Hibridização (45-60 C) Extensão (68-72 C)

35 Fundamentosda PCR Enzima DNA polimerase 95 C 60 C 72 C

36 Fundamentosda PCR

37 Fundamentosda PCR + Thermus aquaticus(1976) (Yellowstone National Park) Pares de iniciadores (Taq DNA polymerase)

38 Fundamentosda PCR 1983 Automação da técnica de PCR 1989 Patente (Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation) 1993 Prêmio Nobel de Química Kary Banks Mullis

39 PCR Amplificação da sequência alvo

40 Fases da PCR: princípio básico Reação enzimática: DNA polimerase. Temperatura + ph Temperaturas diferentes: enzima e substrato/produto Produto da reação: Gel (agarose; poliacrilamida). Reagentes Termociclador Gel

41 Fases da PCR: ciclos T C Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo n Tempo

42 Fases da PCR: ciclos Termocicladores

43 Fases da PCR: amplificação da sequência alvo

44 Fases da PCR: amplificação da sequência alvo

45 Fases da PCR: amplificação da sequência alvo Rate of PCR 2 n 1.8E E E+09 DNA copy number 1.2E E E E E E E PCR cycle Número de moléculas de DNA

46 Fases da PCR: amplificação da sequência alvo Cópias Ciclos Platô Cópias do DNA: Cópias do alvo:

47 Fases da PCR: amplificação da sequência alvo Linear Baixa eficiência Platô Sem amplificação Log [DNA] Exponencial Alta eficiência N de Ciclos

48 Fases da PCR: amplificação da sequência alvo Platô Sem amplificação Detecção em gel Perda da atividade da enzima; Todas as enzimas disponíveis estão ocupadas com a síntese de DNA; Acúmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre si, em detrimento do pareamento com os iniciadores; Gasto dos reagentes, especialmente dos inciadores e dos dntps; Acúmulo de pirofosfato(resultante das ligações fosfodiéster); Competição com outros produtos que vinham sendo amplificados; INIBIÇÃO PELOS PRODUTOS.

49 PCR Aplicações da técnica

50 Aplicaçõesda técnica de PCR Identificação de espécies Iniciadores para cada espécie Amplificação de genes específicos (Ausência nas outras espécies) Diagnóstico molecular Iniciadores específicos Presença/ausência do gene (positivo ou negativo para o teste)

51 Aplicaçõesda técnica de PCR Medicina forense Identificação humana Marcadores humanos específicos (necessidade de controles) Teste de paternidade Identificação humana Marcadores humanos específicos (teste em todos os envolvidos)

52 Aplicaçõesda técnica de PCR As diferentes aplicações da técnica de PCR: Amplificação de fragmentos específicos de DNA; Clonagem; Medicina forense; Diagnóstico molecular; Detecção de mutações; Identificação de espécies; Análises de expressão gênica; Filogenia molecular...

53 PCR Variações da técnica

54 Variaçõesda Técnica de PCR Touchdown PCR e Hot start DNA pol RAPD, AFLP e RFLP Nested PCR Multiplex PCR e Rep-PCR SSCP PCR assimétrica e LATE-PCR PCR inversa QC-PCR Long PCR e PCR in situ (PRINS) RACE PCR digital Transcrição Reversa seguida de PCR (RT-PCR) PCR quantitativa em tempo real (qpcr)

55 Variações da PCR: RT-PCR Transcrição Reversa mrna cdna

56 Variações da PCR: RT-PCR Permite a análise de transcritos (mrna) Análises fenotípicas de expressão gênica

57 Variações da PCR: RT-PCR Padronização; Baixa sensibilidade; Baixa resolução; Pobre discriminação entre os produtos amplificados; Técnica qualitativa (pouco quantitativa); Não automatizado , 315 ou 325 pb? 50, 55 ou 70 ng?

58 Variações da PCR: qpcr PCR quantitativa em tempo real (qpcr) Método baseado na PCR convencional (presença de fluoróforos) Monitoramento contínuo de um sinal fluorescente ao logo dos ciclos Permite análise de dados durante todo o processo (Real-Time). Conversão do sinal fluorescente em valor numérico para cada amostra. Desnaturação Hibridização Extensão

59 Variações da PCR: qpcr

60 Variações da PCR: qpcr Aumento da quantidade de um produto de amplificação Aumento da fluorescência

61 Variações da PCR: qpcr Ciclos

62 MIQE Guidelines

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