Técnicas de Biologia Molecular. Digestão de DNA com enzimas de restrição e eletroforese em gel de agarose

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Nathalia Cunha Carmona
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1 Técnicas de Biologia Molecular Digestão de DNA com enzimas de restrição e eletroforese em gel de agarose 1

2 Enzimas de Restrição Endonucleases sítio-específicas isoladas de procariotos Protegem a bactéria do ataque de vírus Protegem seu próprio DNA metilando-o no sítio de restrição Enzimas do tipo II são as mais utilizadas em Biologia Molecular EcoRI metilase Classes of Restriction Enzymes Type I cleavage occurs bp from recognition site Type II cleavage occurs adjacent or within recognition site Type III cleavage occurs bp from recognition site Características dos sítios de restrição Tipicamente, são seqüências palindrômicas de 4-8 bp Algumas enzimas toleram alguma degeneração no sítio Clivagem produz extremidades 5 -PO 4 e 3 -OH Enzyme ClaI EcoRI FnuAI HaeIII HindII HindIII PstI Site A T C G A T T A G C T A G A A T T C C T T A A G G A N T C C T N A G G G C C C C G G G T Y R A C C A R Y T G A A G C T T T T C G A A C T G C A G G A C G T C 2

3 Extremidades Geradas 5 -salientes Bam HI 3 -salientes Kpn I Abruptas (cegas) Sma I Freqüência de corte no sítio de restrição Sítios estão espalhados randomicamente no genoma Número estimado depende da composição de bases: Para conteúdo de 50% GC : G A A T T C (¼) (¼) (¼) (¼) (¼) (¼) = 1/4096 Se o genoma for = 4 x 10 6, então há 1000 sítios Distribuição randômica implica na geração de fragmentos de diversos tamanhos 3

4 Eletroforese em gel Ácidos nucléicos têm carga global negativa (PO 4- ) Gel de agarose ou acrilamida Migração inversamente proporcional ao tamanho Influência da topologia linear vs. circular Fita dupla vs. fita simples acrilamida 4

5 Eletroforese de gel de agarose Aplicar voltagem constante Detectar com corante fluorescente (brometo de etídeo, SYBR, etc) 5

6 Cálculo do tamanho de fragmentos Plotar mobilidade relativa contra log [tamanho] em pb Melhor usar dsdna linear log(bp) Mobilidade (cm) 6

7 Digestão DNA Linear X Digestão DNA Circular Digestão (2 sítios de restrição) Digestão de DNAs com múltiplos sítios de restrição 7

8 Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE) Configuração de eletrodos do aparato CHEF (contoured-clamp homogeneous electric field) Técnicas de Hibridização 8

As fitas de DNA podem ser separadas em condições que quebram as ligações de hidrogênio Fitas duplas (duplexes) podem se formar in vitro Formação dos duplexes depende da complementaridade das

9 As fitas de DNA podem ser separadas em condições que quebram as ligações de hidrogênio Fitas duplas (duplexes) podem se formar in vitro Formação dos duplexes depende da complementaridade das seqüências Sondas homólogas podem ser usadas para detectar ácidos nucleicos específicos calor Técnicas 1) Southern Blot: deteção de DNA: sonda é DNA ou RNA marcados. 2) Northern Blot: deteção de RNA: sonda é DNA ou RNA marcados. 9

10 Hibridização de ácidos nucléicos Southern Blot Descrito pelo Dr. Southern (1975) Digestão do DNA seguido de eletroforese Transferência para membrana (imobilização) Detecção com sonda (radioativa ou não) Northern Blot Eletroforese de RNA Exemplos de sondas Fragmentos de DNA clonados Oligonucleotídeos sintéticos RNA (riboprobes) Northern e Southern Blot Northern blot Southern blot 10

Transferência do DNA/RNA para membrana Ação

11 Transferência do DNA/RNA para membrana Ação capilar Hibridização A sonda (DNA, RNA) é adicionada à membrana e, então, incuba-se por um tempo suficiente para permitir a interação. No caso do Southern e Northern Blot, a temperatura de incubação é um parâmetro essencial 11

12 Melting Temperature (T m ) e Estringência Melting Temperature (Tm) temperatura em que 50% das fitas estão separação Estringência Refere-se às condições experimentais que favorecem a hibridização (temperatura de incubação e concentração de sais) Reflete a homologia entre a sonda e o alvo alta moderada baixa T m - 15 o C T m - 25 o C T m - 35 o C Detecção dos híbrido sondamolécula-alvo Autoradiografia: exposição da membrana a um filme de raios X (se a sonda for radioativa) Detecção de atividade enzimática: sondas não-radioativas marcadas com enzimas incubação com substrato que pode gerar luz ou um preciptado colorido 12

13 Autorradiografia: exposição da membrana a um filme de raios X Resumo 13

14 Marcação radioativa de sondas de DNA Nick translation Random priming Nick translation Target dsdna A Digestão nick with a 3Õ-OH branda terminus com has been introduced by Dnase I into the DNA duplex The DNAseI first nucleotide produz on the cortes 5Õ-P side of (nicks) has been removed The 5-3 exonuclease and the 5-3 polymerase plus dntp's one of which is labelled Ação Exo 5 3 e Polimerásica A 5 3 da nucleotide has DNA been inserted Pol I to na replace the presença one removed. de The dntp nick has sendo been translated um one deles position radioativo along the chain in a 5Õ to 3Õ direction The nick has now translated 4 positions along the DNA chain. The process continues 14

15 Random Priming usar α[ 32 P]dNTP Klenow = DNA Pol. I sem atividade Exo 5 3 Aplicações das técnicas de hibridização 15

Aplicações Teste de paternidade/maternidade Identificação criminal (forense) Diagnóstico de doenças genéticas Fingerprinting genético Uso de sonda de DNA repetitivo produz uma

16 Aplicações Teste de paternidade/maternidade Identificação criminal (forense) Diagnóstico de doenças genéticas Fingerprinting genético Uso de sonda de DNA repetitivo produz uma padrão complexo de bandas no Southern Blot Distinção de espécies, cepas, indivíduos, etc Pode ser usado no diagnóstico, taxonomia e análises forenses Isolados de M. tuberculosis 16

17 Identificação forense: o caso da família Romanov Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis. Nature Genetics 6, (1994) DNA Fingerprinting 17

18 Teste de Paternidade Teste de Paternidade MOM = Mãe DAD = Pai D1 e S1 = Filha e Filho de MOM e DAD D2 = Filha do primeiro casamento de MOM S2 = Filho adotivo 18

Também é sensível a eventos de inserção e deleçãos Polimorfismos não precisam estar

19 RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms Ganho ou perda de sítios de restrição produzem fragmentos de DNA de diferentes tamanhos para análise por Southern blot Também é sensível a eventos de inserção e deleçãos Polimorfismos não precisam estar relacionados com o locus genético da sonda Diagnóstico de doenças genéticas por RFLP 19

20 Seqüenciamento de DNA Estratégias de Seqüenciamento Método de Maxim & Gilbert: técnica química (em desuso) Método de Sanger (1977): Reação de Terminação da Cadeia (técnica enzimática) Pré-requisitos: DNA polimerase, magnésio primer dntps (substrato) ddntps (análogos dos dntps) 20

21 Reação da DNA Polimerase Dideoxirribonucleotídeo 21

22 O 5 O = P - CH 2 O H o 3 2 BASE H O H 5 O = P - CH 2 3 O H o 2 BASE H H H Fim de Cadeia template 3 5 primer 5 3 DNA pol dntp 22

23 + 1 dntp radioativo 23

PRINCIPAIS APERFEIÇOAMENTOS DA TÉCNICA AUTOMAÇÃO Introdução de instrumentos de seqüenciamento baseados em capilares e leitura ótica a laser da fluorescência 96 amostras em paralelo Seqüenciamento

24 PRINCIPAIS APERFEIÇOAMENTOS DA TÉCNICA AUTOMAÇÃO Introdução de instrumentos de seqüenciamento baseados em capilares e leitura ótica a laser da fluorescência 96 amostras em paralelo Seqüenciamento automático de DNA ddntps ligados a uma molécula fluorescente todos os fragmentos terminando em um ddntp específico apresentam uma cor particular todos os 4 ddntps marcados em um único tubo separação dos fragmentos em capilar feixe de luz lazer seqüência de DNA seqüência de cores 24

25 PRINCIPAIS APERFEIÇOAMENTOS DA TÉCNICA Desenvolvimento da bioinformática, com sistemas de softwares para interpretação dos dados gerados e montagem das seqüências. Reação em Cadeia da Polimerase Polymerase Chain Reaction (PCR) 25

26 Técnicas de Hibridização: Limitações requerem muito DNA (µg) DNA tem que estar bem puro tempo do ensaio: até uma semana Polymerase Chain Reaction (PCR) Fragmentos específicos de DNA são enzimaticamente amplificados Amplificação de até 10 6 X é possível! Pode detectar até 1 molécula! Tolera DNA relativamente impuro Tempo: menos de 1 dia! 26

27 Kary Mullis (1985) PCR O que é necessário?? Termociclador DNA Molde (template) Primers dntps DNA Polimerase Mg 2+ 27

28 Taq Polimerase DNA polimerase de Thermus aquaticus: organismo termofílico Enzima resiste a altas temperaturas Temp. ótima: º C Princípio da Técnica Reação de Replicação in vitro 1. Desnaturação: 94ºC 2. Anelamento (Tm): 45ºC - 60ºC 3. Polimerização: 72 C Cálculo do Tm: T m = 2(A + T) + 4(G + C) 28

29 Desnaturação do template 95ºC Anelamento dos primers 45-65ºC Extensão pela polimerase 72ºC 29

30 Algumas Aplicações clínicas do PCR Clonagem de genes Screening de genes mutantes Determinação de sexo pré-natal Diagnóstico de doenças genéticas Detecção de infecções Monitoração de terapia contra o câncer 30

31 Identificação 31

32 Aplicações não-clínicas Seqüenciamento de DNA Screening de clones Estudos de ecologia e evolução molecular Identificação de organismos transgênicos Fingerprinting forense 32

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