DNA recombinante, PCR e Eletroforese

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ SETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E FITOSSANITARISMO AF 060- Biotecnologia Vegetal DNA recombinante, PCR e Eletroforese Professores: Bruno Portela Brasileiro Renata Faier Calegario

2 BIOLOGIA MOLECULAR Possibilita a manipulação de moléculas => introdução de genes em um genoma receptor Depende: Tecnologia do DNA recombinante Enzimas cortar, copiar e colar o DNA Bases nitrogenadas

3 Enzimas DNA polimerase DNA ligase Enzimas de restrição Arthur Kornberg Martin Gellert Werner Arber

4 Stanley Cohen Plasmídeos

5 DNA RECOMBINANTE Ferramenta permite: Clivar DNA com enzimas de restrição Inserir DNA eucariótico em bactérias Determinar a sequência de nt de um fragmento de DNA Amplificar e sintetizar DNA Recombinar fragmentos de DNA, etc.

6 MANIPULAÇÃO DO DNA Enzimas de Restrição Reconhecem e cortam sequências específicas do DNA Encontradas em ampla variedade de procariotos (clivar moléculas de DNA exógeno) Isolamento de genes e criação de moléculas novas de DNA Reconhecem sequências de 4 a 8 nucleotídeos Sítios de Clivagem: hidrolisa ligações fosfodiéster

7 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Sequências Palindrômicas (repetições invertidas): sequência das duas cadeias é igual quando for lida de 5 para

8 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Extremidade Coesiva Extremidade Cega (Abrupta) Clonagem: Mais utilizados fragmentos gerados com extremidades coesivas > eficiência de ligação

9 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Enzimas com diferentes especificidades já foram purificadas: Denominação Origem Sequência de Reconhecimento Abreviação de 3 letras do nome da espécie Seguida da designação da linhagem Número Romano: se mais de uma enzima é produzida

10 ENZIMAS DE LIGAÇÃO Restabelecem as ligações fosfodiéster entre os nucleotídeos (hidroxila 3 + fosfato 5 ) Capacidade de ligar dois cortes produzidos pela mesma enzima de restrição O DNA 3 OH + - O P O 5 DNA - O O DNA-Ligase ATP ou NAD Ex: T4 DNA ligase DNA 3 O P O 5 - O DNA

11 DNA RECOMBINANTE

12 DNA RECOMBINANTE

13 DNA RECOMBINANTE

14 Reação em cadeia da polimerase (PCR) A revelação me ocorreu numa noite enluarada de sexta-feira de abril de 1983, enquanto dirigia por uma estradinha tortuosa nas montanhas do norte da Califórnia que atravessa uma floresta de sequóias. Kary Mullis

15 TESTES MOLECULARES PCR: Polymerase Chain Reaction Reação de Polimerização em cadeia Método in vitro para produzir DNA Baseado nas propriedades do DNA: Desnaturação e Renaturação Elementos necessários: DNA molde: Proveniente de extração Componentes da Replicação: DNA polimerase, primers e nucleotídeos Kary Mullis: 1983 Prêmio Nobel: 1993

16 REPLICAÇÃO X PCR Quais os elementos necessário para a Replicação do DNA? CÉLULA DNA molde Abertura das fitas = helicase Nucleotídeos Primers = Primase Adição de nt = síntese IN VITRO DNA: extrair Temperatura Nt Sintéticos Primer: desenhar DNA polimerase

17 REAÇÃO DE PCR Todos elementos são adicionados ao tubo (eppendorf) DNA extraído: 20 a 200ng dntps: Nucleótidos livres A, T, C, G DNA Par de Primers (iniciadores) => anelando nas bordas da região a ser amplificada Taq DNA polimerase: Thermus aquaticus (estável em T ) Tampão 10X: estabiliza ph Mg +2 Tampão 10X dntps datp dttp dctp dgtp Primer 5-3 Taq DNA Polimerase H 2 O Primer 3 5 MgCl 2: ajuda ligação dos primers e cofatores (Mg +2 ) Taq 25µL Figura:

18 PCR Equipamento necessário: Termociclador Propicia ciclos de temperaturas 1 Ciclo Desnaturação = 94 C Anelamento = 54 C Extensão = 72 C Ao final da Reação: => Amplificação da sequência específica do DNA = amplicon => Tamanho e sequência definidos => Grande quantidade

19 PCR Recomendações: Limpe a bancada de trabalho ao começar e ao terminar Adicione o DNA por último na reação: evita transferência de amostras de DNA de um tubo para outro Faça sempre um controle negativo, sem DNA. Prepare-o por último - representativo da manipulação Controle positivo: material conhecidamente positivo

20 PRIMERS O QUE É UM PRIMER? Sequência de nucleotídeos complementar às extremidades da sequência alvo do DNA Tamanho: nucleótidos Deve corresponder a uma sequência única dentro do DNA a ser amplificado COMO FAZER UM PRIMER? Conhecer a sequência do gene Lembrar: Polimerização sempre 5-3

21 PRIMERS Sequência do Gene 5 - GTTCTAGGATCGACTCTAAGTTGAATTATGAGAAATTGTGTGATTTTGTC AACACTGAGTCGAGACCCCTGGCTAGGACTTTCCGTAGTCCTCCAGATGT TATGCCTACCGTATGCAGCAAATTTACGGTAAGTCACTTAAAGGCCTGACC ATACAGTGTTTGAGCAAGAATCAGGACACTTCTCCAAGCGTCTCTAAGCTT GTTATCACAAAGAATTATAGGTTTGGACAGAATTTTATACGCGAAGTCTTTG ATAAAATTGGACATGCTTAGCTTTTATGGTAATGGTGGTATGATCTTTACAG ATTGCTGTAGTACTATACACCAGTTTCAGGGTAGTGACGCTGAATATGTTG TTGTCATGCGCCTGACATATGCTGAGTAAGTCTATTTTTATGGATGAAAGG CAATGTCTTGTCGCATAAGACTAGGCACACTATGCGAATGGTCTACG

22 PRIMERS Fita 1 - Molde 5 GTTCTAGGATCGACTCTAAG - 3 Fita 2 - Complementar 3 CAAGATCCTAGCTGAGATTCATTGAATTATGAGAAATTGTGTGATTTTC. 5 Sequência do Primer Forward (Left) 5 - GTTCTAGGATCGACTCTAAG - 3 Amplifica Fita 5-3 molde Fita 1 - Molde 5 CAATGTCTTGTCGCATAAGACTAGGCACACTATGCGAATGGTCTACG...3 Fita 2 - Complementar 3 - GTGATACGCTTACCAGATGC 5 Sequência do Primer Reverse (Right) 5 - CGTAGACCATTCGCA TAGTG- 3 Amplifica Fita 5-3 Complem.

23 Tamanho: bases Composição: 50% C+G Extremidade 3 com G ou C PRIMERS Características desejáveis dos Primers Evitar três ou mais Gs ou Cs (3 ): Anelamento inespecífico em regiões ricas em G ou C Evitar primers F e R com complementaridade de bases (dímeros de primers) Evitar complementaridade de bases no próprio primer (hairpin, estruturas secundárias)

24 PRIMERS Condições de Anelamento TEMPERATURA Determina o anelamento específico Temperatura alta: maior especificidade Temperatura baixa: menor especificidade Depende da %GC Temp. Anelamento: ~ 5 º C abaixo do menor Tm do par de primers Tm varia de o C : Tm dos dois primers próximas

25 PRIMERS Melting Temperature (TM) = Temperatura Desnaturação Tm = 2 (A+T) + 4 (G + C) Fórmula de Wallace Sequência do Primer Forward (Left) 5 - GTTCTAGGATCGACTCTAAG - 3 Tm = 2 (5 + 6) + 4 (5 + 4) Tm = 58 C TA = 53 C

26 PCR Equipamento necessário: Termociclador Propicia temperaturas distintas 1 Ciclo Desnaturação = 94 C Anelamento = 54 C Extensão = 72 C

27 REAÇÃO DE PCR Anelamento ou Reverse Primer Forward Primer Reverse Forward

28 REAÇÃO DE PCR

29 REAÇÃO DE PCR

30 1 CICLO

31 APÓS REAÇÃO Quantidade de cópias aumenta em progressão geométrica Cada uma das novas fitas de DNA sintetizadas a partir dos primers serve como molde para síntese de uma nova fita. Quantidade de cópias = 2 n Onde, n = n de ciclos 2 31 = 2 bilhões de cópias do fragmento

32 ANÁLISE DA PCR Verificar se houve amplificação do fragmento de interesse Eletroforese: Análise em gel de agarose Concentração: 0,8% e 1% (acordo com tamanho fragmento) Marcador conhecido: para estimar o peso molecular Gel é corado com brometo de etídio, visualizado luz UV Presença de Banda = Positivo Ausência de Banda = Negativo Amostras comparadas ao marcador determinando-se o tamanho do fragmento de DNA amplificado

33 ANÁLISE DA PCR Detecção do gene Vip3A em cepas transformadas Bacillus turingiensis (A) Esquema da localização relativa no gene dos primers utilizados para os experimentos de PCR e o isolamento do Vip3A B) Resultados de amplificação para a cepa HD125, confirmando a presença do gene, que demonstrou ser 99,8% idêntico à sequência de nucleotídeos publicada para o gene Vip3A(a) Milho Bt - Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002

34 ANÁLISE DA PCR Detecção de begomovírus em plantas de Tabaco Rep CP Fragmento com aproximadamente nucleotídeos para o DNA A, compreendendo as extremidades 5' dos genes Rep e Cp e toda região comum Calegario et al. Pesq. agropec. bras., Brasília, v.42, n.9, p , set. 2007

35 PCR Vantagens: - Sensível (fentograma: ) - Rápido - Grande n amostras Desvantagens: - Apresenta alguns falsos positivos - Importante controles +/- Controle negativo = sem DNA Controle negativo = com DNA, sem primer Controle positivo = amostra conhecidamente positiva

36 PCR APLICAÇÕES - Detecção de genes em DNA genômico - Clonagem de DNA - Sequenciamento - Evolução molecular - Análise de estrutura genômica - Identificação de mutações - Diagnóstico de doenças: humanos, animas e de plantas - Teste de paternidade...

37 COMO ANALISAR O DNA Eletroforese Método para separar ácidos nucleicos e proteínas Base: mobilidade de partículas em um suporte sólido sob ação de um campo elétrico Separação de acordo com: o tamanho, forma e carga elétrica DNA contém carga negativa => migra para o polo positivo DNA com diferentes tamanhos => migram em velocidades diferentes => formam diferentes bandas

38 ELETROFORESE Meios de suporte sólido Gel Agarose = agarose (polissacarídeo) => separação de fragmentos pequenos e grandes Gel Acrilamida = acrilamida e bisacrilamida (polímeros) => separação de proteínas ou partículas muito pequenas Visualização das bandas: corantes de DNA Brometo de etídio (carcinogênico e teratogênico) SYBRGreen GelRed Moléculas se ligam ao DNA

39 ELETROFORESE

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41 ELETROFORESE Fonte Gel - Cuba de eletroforese + Luz UV Gel

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43 ELETROFORESE

44 LABORATÓRIO DE BIOMOL Recomendações: Uso de luvas e Material estéril Soluções autoclavadas Exceção: enzimas, detergentes, DNA e RNA, etc Água: deionizada (autoclavada) Cuidado com soluções tóxicas, carcinogênicas e teratogênicas: Brometo de etídeo, Fenol, Clorofórmio, βme, Luz UV.

45 INTRODUÇÃO Isolamento do DNA da planta = Extração de DNA Fundamental para análise de DNA exógeno no genoma vegetal 1º Passo para Técnicas Moleculares de detecção Confirmar a integração do DNA exógeno PCR = Presente ou ausente Southern Blot = Nº de cópias

46 EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS Diferentes protocolos => variam em função da espécie e do tecido a ser utilizado Reflete a variabilidade da composição bioquímica de diferentes plantas e tecidos Maioria dos protocolos => variação de 2 protocolos básicos Dellaporta et al (1983) Baseado na precipitação de proteínas e polissacarídeos por acetato de potássio na presença de SDS Doyle & Doyle, (1987) Baseado na utilização do detergente CTAB Romper as membranas celulares para liberação do DNA Romano, 1998

47 EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS Você deve ter em mente: Isolar o DNA de outros constituintes celulares: lipídeos, proteínas e polissacarídeos Manter Integridade: informação/sequência Polifenois e polissacarídeos = interferem na atividade de enzimas usadas para manipulação de DNA => ligases, polimerases e enzimas de restrição Use tubos plástico novos e esterilizados => O DNA apresenta grande afinidade pelo vidro (evite-o)

48 EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS Etapas básicas de protocolos de extração Lise celular = liberar o DNA N 2 líquido Diretamente no Tampão de extração Tampão de extração Tris ph 8.0 e 9.0 = mantém ph (desfavorável às DNAses, ph 7.0) EDTA = agente quelante Mg +2 e Ca +2 (co-fator de DNAses) β-mercaptoetanol = antioxidante e desnatura enzimas => DNA oxidado é inacessível às enzimas de restrição

49 EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS Tampão de extração (continuação) NaCl = auxilia na dissociação de proteínas ligadas aos ácidos nucleicos (íons rompem ligações de cadeias polipeptídicas) CTAB e SDS = detergentes = auxiliam na lise das membranas celulares (libera os componentes) Junto com NaCl = forma um complexo com o DNA Usado para precipitar o DNA seletivamente RNAse = elimina RNA

50 EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS Desnaturação das proteínas com solventes orgânicos Fenol Clorofórmio:álcool isoamílico Centrifugação Fase aquosa (superior): DNA + Contaminantes (Polissacarídeos e RNAs) Interface: proteínas desnaturadas Fase orgânica (inferior): Lipídeos, polissacarídeos Recuperação do DNA: Precipitação Isopropanol ou álcool absoluto = DNA desidrata e precipita Acetato de amônio = remove fenóis ou polissacarídeos Acetato de potássio (+SDS) = precipita proteínas e polissacarídeos Lavagem do DNA: remoção de sal Etanol 70%

51 Romano, 1998 EXTRAÇÃO DE DNA: MÉTODO CTAB CTAB, NaCl, Tris, EDTA, β me, H 2 O

52 EXTRAÇÃO DE DNA DE TECIDOS VEGETAIS Problemas comumente encontrados: Contaminação por polifenóis: cor marrom do DNA (oxidação) Co-isolamento de polissacarídeos: aspecto gelatinoso e muito viscoso Presença de DNAses endógenas: visualização do DNA genômico em gel de agarose degradado (arraste vertical) Baixa qualidade do DNA

53 Romano & Brasleiro, 1998 PROBLEMAS, CAUSAS E SOLUÇÕES

54 PROBLEMAS, CAUSAS E SOLUÇÕES Continuação Romano & Brasileiro, 1998

55 ANÁLISE DA EXTRAÇÃO Avaliação DNA purificado: Concentração e Pureza Análise da OD em espectrofotômetro DNA absorve luz no 260 nm / Proteínas a 280 nm 1 OD 260 = 50 mg de DNA DNA = leitura DO260 x 50 x fator de diluição Parâmetro da qualidade do DNA => Relação DO260/DO280 Valores < 1,8 => contaminação com proteínas Valores >1,8 => contaminação com fenol

56 ANÁLISE DA EXTRAÇÃO Eletroforese: Análise em gel de agarose Concentração: 0,8% e 1% Marcador: DNA de concentração conhecida (Padrão) Gel é corado com brometo de etídio, visualizado luz UV Amostras comparadas aos padrões, determinando-se as concentrações aproximadas de DNA em cada amostra

57 ANÁLISE DA EXTRAÇÃO 1Kb = 1000pb

58 ANÁLISE DA EXTRAÇÃO Análise em gel de agarose: DNA genômico de Plantas Kit de extração DNA 1-4 = DNA Folha Tabaco 5-8 = DNA Arroz Sorgo Folha Arroz Folha Trigo HiPurA - Hemedia

59 ANÁLISE DA EXTRAÇÃO Moléculas de DNA de mesmo tamanho = migram com diferentes velocidades na forma circular relaxada, linear ou supertorcida A dupla-hélice enrola-se sob si mesma 5 Min 30 Min Tratamento com Topoisomerase Promovem a quebra transitória nas pontes fosfodiéster adicionando ou removendo superenrolamentos

60 HIBRIDIZAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS Ácidos nucleicos: capacidade de hibridização Sequências complementares pareiam Estrutura Duplex Teste de complementaridade DNA RNA Southern Blot Northern Blot

61 SOUTHERN BLOT Detecta fragmento do DNA específico no DNA genômico COMO? Sonda: sequência complementar de DNA alvo Introdução de nucleotídeos marcados em sequências de DNA Sondas Radioativas = nt 32 P Não-Radioativas = nt biotina/digoxigenina (colorimétrica ou quimioluminescente)

62 Marcação de Sonda Nick Translation DNAse: digestão controlada DNA polimerase I Atividade exonucleásica = do lado 5 -P do corte retira nt Atividade polimerásica = adiciona nt do lado 3 -OH do corte Marcação por Random primers Primers aleatórios anelam vários pontos do DNA dntps marcados e não marcados Fragmento Klenow da DNA polimerase I

63 KIT DE MARCAÇÃO Kit Dig DNA Labeling: Randon Primers Produto PCR purificado Fervido: 100 C/10 min => Gelo PCR desnaturado Nt (primers aleatórios - hexameros) dntp- Digoxigenina Enzima Klenow DNA Polimerase I Δ 37 C 12hs

64 SOUTHERN BLOT Tratamentos: Depurinação Desnaturação Neutralização TRANSFERÊNCIA Gel: Fragmentos DNA - REVELAÇÃO Lavagens Retira excesso de sonda HIBRIDIZAÇÃO

65 O QUE ACONTECE NA MEMBRANA IgG anti-digoxigenina conjugado com Fosfatase alcalina DNA imobilizado E E E Nucleotídeos marcados com digoxigenina Sonda fria Membrana (+) Adição substrato NBT/BCIP: clivagem e precipitação sobre a membrana

66 SOUTERN BLOT Plantas Transgênicas de Soja: seleção de eventos positivos PCR Cópias do transgene DNA total Hind III α 32 P: d-ctp VIII Jornada Acadêmica da Embrapa Soja Souther Blot Separou fragmentos Gel - 3hs Hibridização 18hs

67 SOUTERN BLOT Poucas cópias: Importante para a expressão estável Em estudos de expressão gênica => facilita a interpretação da real interação entre as moléculas Alto número de inserções do transgene: Possibilita rearranjos complexos das inserções que podem levar a perda das mesmas ou ao silenciamento Pode comprometer o desenvolvimento e metabolismo da planta, pelo efeito posicional das inserções (podem comprometer genes do metabolismo primário)

68 SOUTERN BLOT Plantas Transgênicas de Batata 1 e 5: Marcador Peso Molecular 2 e 4: DNA total batata transgênica digerido com Eco RI 3: DNA total batata Não-transgênica digerido com Eco RI DNA total digerido Eco RI Southern Blot do gel

69 SOUTHERN BLOT Vantagens: Sensibilidade (fentograma) Quantitativa: nº de cópias do gene integradas ao genoma Envio de membranas para outro laboratório Desvantagens: Demorado Caro Perigoso (sondas radioativas) É limitada quando o local exato do gene de interesse é desconhecido

70 SOUTHERN BLOT APLICAÇÕES - Importante experimentos de Transformação => Prova molecular da integração do gene exógeno no genoma vegetal - Bandas com PM diferente do controle + => indicativo de alterações no material genético - Detecta fragmento específico em meio a milhões de fragmentos - Usado para distinguir estirpes de um organismo