Reação em Cadeia Da Polimerase

Transcrição

1 Reação em Cadeia Da Polimerase X Jornada Farmacêutica IV Amostra 2010 Sueli Massumi Nakatani LACEN-PR

2 Um Pouco de História...

3 Um Pouco de História Kary Mullis for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method Nobel Prize in Chemistry

4 Reação em Cadeia pela Polimerase PCR Diagnóstico de doenças Infecto-Contagiosas Detecção de doenças Hereditárias Diagnósticos de Câncer Transplantes Medicina Forense Genoma Humano Alimentos Transgênicos

5 The Economist July 22, 2000

6 O Brasil e os Genomas Completos Nature (2000) 406: Nature (2002) 417: J. Bacteriol. (2003) 185: PNAS (2003) 100:

7 Projetos no Brasil Sugarcane Schistosoma mansoni Eucalyptus Coffee Human Cancer Genome

8 Reação em Cadeia da Polimerase Constitui um mecanismo para detectar, com alta especificidade concentrações extremamente baixas de determinadas seqüências de DNA

9 O DNA principais características Dupla-Fita Direcional Anti-Paralelas Complementares A T C G

10 Hibridização A hibridização se baseia em uma das principais características da dupla-fita de DNA a complementaridade das seqüências das duas fitas A dupla fita pode se restabelecer perfeitamente a partir de duas fitas separadas previamente As fitas podem ser separadas pela

11 Hibridização As fitas de DNA podem ser separadas pela ação do calor Com o resfriamento, as fitas complementares encontram-se, umas com as outras, e re-hibridizam

12 Polymerase Chain Reaction Thermus aquaticus, bactéria que vive em altas temperaturas Taq DNA polymerase Life at High Temperatures by Thomas D. Brock - Biotechnology in Yellowstone, 1994 Yellowstone Association for Natural Science

13 Reação em Cadeia da Polimerase

14 Reação em Cadeia da Polimerase PCR é usado para amplificar seqüências específicas de DNA O DNA molde é desnaturado (96 o C) suas fitas são separadas Dois oligonucleotídeos complementares as extremidades 3 do segmento de interesse são adicionados em excesso e a temperatura é diminuída (50-60 o C) Os oligonucleotídeos se hibridizam com seqüências complementares presentes nas moléculas do DNA molde

15 Reação em Cadeia da Polimerase

16 Reação em Cadeia da Polimerase Os óligos funcionam como iniciadores (primers) para a síntese de DNA, a qual se inicia com a adição de nucleotídeos e de uma polimerase resistente a temperatura A Taq Polimerase tem a capacidade de estender os óligos em temperaturas superiores a 72 o C Quanto a síntese esta terminada, aquece-se de novo a 96 o C para, novamente separar-se as dupla-fitas de DNA A repetição (30 40 vezes) deste ciclo de síntese,

17 PCR - P CiCLOS DA PCR Reaction 5 min 45 seg 45 seg 2 min 7 min 96 o C 96 o C 54 o C 72 o C 72 o C X

18 1-Coleta 2-Extração 4-Detecção 3-PCR

19 Etapas para a realização do PCR Etapa 1 - Extração do DNA -RNA Proteinase K Kits comerciais -Genomic Prep Blood DNA Isolation Kit (Amersham Pharmacia Biotech) Método de Boom Fenol clorofórmio

20

21 Etapa 2 - Preparo do Master Mix Mg++ dntp s nucleotídeos Taq polimerase Primers Tampão da enzima H 2 O

22 Etapa 3 Adicionar a amostra ao master mix DNA alvo

23 Etapa 4 - Amplificação no Termociclador Eppendorf Cobas MJ Applied Biosystems

24 Ciclos da PCR Etapa A- Desnaturação por aquecimento 95ºC

25 Ciclos da PCR Etapa B- Hibridização dos Primers Seqüência alvo Primer 2 Primer 1 Seqüência alvo 55ºC a 65ºC

26 Ciclos da PCR Etapa C : Extensão 72ºC Taq polimerase Taq polimerase

27 Ciclo 1 96 o C DNA original = 1 Cópia original = 0 Cópia delimitada = 0 1

28 96 o C DNA original = 1 Cópia original = 0 Cópia delimitada = 0 1

29 54 o C DNA original = 1 Cópia original = 0 Cópia delimitada = 0 1

30 54 o C DNA original = 1 Cópia original = 0 Cópia delimitada = 0 1

31 54 o C DNA original = 1 Cópia original = 0 Cópia delimitada = 0 1

32 72 o C DNA original = 1 Cópia original = 0 + Cópia delimitada = 0 1

33 72 o C DNA original = 1 Cópia original = 0 + Cópia delimitada = 0 1

34 72 o C DNA original = 1 Cópia original = 0 + Cópia delimitada = 0 1

35 72 o C DNA original = 1 Cópia original = 0 + Cópia delimitada = 0 1

36 72 o C DNA original = 1 Cópia original = 0 + Cópia delimitada = 0 1

37 Ciclo 2 96 o C DNA original = 1 Cópia original = 1 Cópia delimitada = 0 2

38 96 o C DNA original = 1 Cópia original = 1 Cópia delimitada = 0 2

39 54 o C DNA original = 1 Cópia original = 1 Cópia delimitada = 0 2

40 54 o C DNA original = 1 Cópia original = 1 Cópia delimitada = 0 2

41 54 o C DNA original = 1 Cópia original = 1 Cópia delimitada = 0 2

42 54 o C DNA original = 1 Cópia original = 1 Cópia delimitada = 0 2

43 72 o C DNA original = 1 Cópia original = 1 + Cópia delimitada = 0 + 2

44 72 o C DNA original = 1 Cópia original = 1 + Cópia delimitada = 0 + 2

45 72 o C DNA original = 1 Cópia original = 1 + Cópia delimitada = 0 + 2

46 72 o C DNA original = 1 Cópia original = 1 + Cópia delimitada = 1 2

47 72 o C DNA original = 1 Cópia original = 1 + Cópia delimitada = 1 2

48 72 o C DNA original = 1 Cópia original = 1 + Cópia delimitada = 1 2

49 72 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 Cópia delimitada = 1 2

50 Ciclo 3 96 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 Cópia delimitada = 1 3

51 96 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 Cópia delimitada = 1 3

52 54 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 Cópia delimitada = 1 3

53 54 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 Cópia delimitada = 1 3

54 54 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 Cópia delimitada = 1 3

55 54 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 Cópia delimitada = 1 3

56 54 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 Cópia delimitada = 1 3

57 72 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 + Cópia delimitada = 1 + 3

58 72 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 + Cópia delimitada = 1 + 3

59 72 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 + Cópia delimitada = 1 + 3

60 72 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 + Cópia delimitada = 4 3

61 72 o C DNA original = 1 Cópia original = 2 + Cópia delimitada = 4 3

62 72 o C DNA original = 1 Cópia original = 3 Cópia delimitada = 4 3

63 Ciclo 4 96 o C DNA original = 1 Cópia original = 3 Cópia delimitada = 4 4

64 96 o C DNA original = 1 Cópia original = 3 Cópia delimitada = 4 4

65 54 o C DNA original = 1 Cópia original = 3 Cópia delimitada = 4 4

66 54 o C DNA original = 1 Cópia original = 3 Cópia delimitada = 4 4

67 54 o C DNA original = 1 Cópia original = 3 Cópia delimitada = 4 4

68 54 o C DNA original = 1 Cópia original = 3 Cópia delimitada = 4 4

69 54 o C DNA original = 1 Cópia original = 3 Cópia delimitada = 4 4

70 72 o C DNA original = 1 Cópia original = 3 + Cópia delimitada = 4 + 4

71 72 o C DNA original = 1 Cópia original = 3 + Cópia delimitada = 4 + 4

72 72 o C DNA original = 1 Cópia original = 4 Cópia delimitada = 11 4

73 Ciclo Cópia delimitada

74 Etapa 5 - Detecção do Amplificado gel de agarose a 1,5% brometo de etídio

75 Métodos de Detecção dos Produtos de PCR Eletroforese em Gel Horizontal de Agarose Eletroforese em Gel Vertical em Poliacrilamida Hibridização ( sondas radioativas ou não radioativas) Detecção Colorimétrica Restrição Enzimática

76 Gel - Corrida de eletroforese ( - ) ( + )

77 Gel - Corrida de eletroforese ( - ) ( + )

78 Gel - Corrida de eletroforese ( - ) ( + )

79 Gel - Corrida de eletroforese ( - ) Gel - Corrida de eletroforese ( + )

80 Gel - Pipetagem das amostras (PCR)

81 OTIMIZAÇÃO DO PCR Concentração da enzima Deoxinucleotídeos Trifosfatos (dntps) Concentração do Magnésio Anelamento dos primers Extensão do primers Temperatura e Tempo de Desnaturação Números de ciclos

82 Sala 3- Amplificação e Detecção dos Produtos de PCR SETOR DE BIOLOGIA MOLECULAR Sala1- Preparo e Estocagem de Reagentes Preparação do Master Mix Sala 2- Extração e Purificação do DNA RNA Estocagem das Amostras Extraídas Adição dos Ácidos Nucléicos ao Master Mix

83 Fluxo de Trabalho Sala1 Sala 2 Sala 3 Preparação de Reagente Preparação da amostra Amplificação Detecção e Análise dos produtos de PCR

84

85 Controle de qualidade Boas Práticas de Pipetagem Organização laboratorial Vestimentas Controles Cuidados Especiais Descontaminação

86 Tipos de PCR SIMPLES 1 par de primers 1 PCR primer 1 DNA alvo primer 2 amplicon

87 TIPOS DE PCR PCR-RFLP Enzimas de Restrição cortam segmentos de DNA

88 PCR-RFLP

89 Tipos de PCR NESTED-PCR 2 pares de primers 2 PCR DNA alvo primer 1 primer 2 primer 3 amplicon primer 4 amplicon

90 Tipos de PCR MULTIPLEX-PCR vários pares de primers 1 PCR DNA alvo 2 primer 2a primer 2b amplicon primer 1a DNA alvo 1 primer 1b amplicon primer 3a DNA alvo 3 primer 3b amplicon

91 Tipos de PCR RT-PCR 1 primer anti-sense 1 PCR RNA alvo primer 1 cdna

92 Testes Realizados no LACEN Quantificação de Carga Viral HIV-1 PCR Qualitativo para HCV PCR Quantitativo para HCV PCR Qualitativo para HBV PCR para Herpes Simplex virus PCR para Herpes virus 6 PCR para Cytomegalovírus PCR para Epstein Baar vírus (tipo 1 e 2) PCR para Parvo vírus B19 PCR para Varicella zoster PCR para Mycobacterium avium PCR para Mycobacterium tuberculosis PCR para leptospira sp PCR para Toxoplasmose PCR Quantitativo para HBV pela técnica