ELETROFORESE APLICADA À ANÁLISE DE DNA

Transcrição

1 ELETROFORESE APLICADA À ANÁLISE DE DNA

2 Eletroforese Separação de moléculas carregadas em um campo elétrico. As moléculas em uma mistura são separadas umas das outras conforme o tamanho ou a carga

3 Eletroforese Utilização a partir de 1970 DNA tem carga negativa Migração diferencial dos fragmentos Matriz: Agarose Poliacrilamida

4 Cuba de eletroforese Eletroforese em gel de acrilamida

5 Equipamentos de eletroforese Fonte Cuba vertical

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9 Pente Eletroforese Fonte de eletricidade Cátodo Gel de agarose A Molde Ánodo C Cánodo - Fragmentos de DNA Gel de agarose Ánodo + Solução tampão Cuba de eletroforese D Fragmentos de DNA menores migram mais rapidamente através do gel B

10 Equipamentos de eletroforese método

11 Eletroforese de DNA

12 Eletroforese Gel de poliacrilamida separa fragmentos pequenos: pb (pares de base) poder de resolução acurado géis correm em uma configuração vertical em um campo elétrico constante Gel de agarose tem menor poder de resolução do que o gel de poliacrilamida; separa grandes fragmentos de DNA (200pb - 50 Kb) em diferentes concentrações de agarose corre em configuração horizontal em campo elétrico com intensidade e direções constantes

13 ELETROFORESE Agarose: - polímero linear extraído de algas marinhas - o gel é preparado na presença de um tampão apropriado sob aquecimento - após resfriamento da agarose em um suporte adequado, a matriz formada possui uma densidade determinada pela concentração da agarose - quando um campo elétrico é aplicado através do gel, o DNA (carregado negativamente) migra em direção ao polo positivo

14 ELETROFORESE Fragmentos lineares de DNA de tamanhos diferentes migram a taxas diferentes através dos géis com diferentes concentrações de agarose quantidade de agarorse no gel (% w/v) tamanho do fragmento (kb) (intervalo eficiente de separação) 0, ,7 0,8-10 0,9 0,5-7 1,2 0,4-6 1,5 0,2-3 2,0 0,1-2

15 ELETROFORESE Tampões de eletroforese - a mobilidade eletroforética do DNA é afetada pela composição e força iônica do tampão - géis preparados com água - condutividade elétrica é mínima: DNA migra muito lentamente ou não migra - tampões muito concentrados (alta força iônica) a condutividade elétrica é muito alta e gera muito calor - DNA pode desnaturar - Tampões mais utilizados: TAE = tris/acetato/edta (ph alcalino) TBE = tris/borato/edta TPE = tris/fosfato/edta

16 ELETROFORESE Visualização do DNA Utilização do corante fluorescente Brometo de Etídeo - contém um grupamento planar que intercala entre a dupla fita do DNA - a radiação ultravioleta a 254 nm é absorvida pelo DNA e transmitida ao corante (pela sua proximidade com as bases nitrogenadas do DNA)

17 Visualização do DNA brometo de etídeo Intercalação do brometo de etídeo na hélice do DNA Molécula de brometo de etídeo

18 ELETROFORESE Corante de corrida eletroforética Utilização do corante azul de bromofenol - Composição do corante: azul de bromofenol - função: glicose H 2 O assegurar que a amostra assente apropriadamente no slot do gel. adicionar cor à amostra para monitoramento da corrida eletroforética o AF migra aproximadamente na mesma taxa que um DNA linear dupla fita de 300 pb

19 ELETROFORESE Corante de corrida eletroforética Loading buffer glicerol + 1 ou 2 corantes que migram no gel permitindo o monitoramento visual da corrida eletroforética - função: assegurar que a amostra assente apropriadamente no slot do gel. adicionar cor à amostra para monitoramento da corrida eletroforética o AF migra aproximadamente na mesma taxa que um DNA linear dupla fita de 300 pb

20 ELETROFORESE Padrões / Marcadores de peso molecular produzidos comercialmente fragmentos gerados por digestão enzimática de uma sequência de DNA previamente conhecida utilizado para medir precisamente o peso molecular da amostra de DNA de interesse: Mais utilizados: corte l com Hind III: , 9416, 6557, 4361, 2322, 564, 125. corte fx174 com HaeIII: 1353, 1078, 872, 603, 310, 281, 271, 234, 194, 118, 72.

21 Visualização do gel de agarose em luz UV

22 Visualização do gel de agarose em luz UV

23 Resultado da eletroforese

24 Foto de gel após eletroforese e marcador de peso molecular

25 Aula 1 Preparação de gel de agarose e aplicação de amostras de DNA no gel para realização da eletroforese Objetivo: Compreender a aplicação da eletroforese como ferramenta auxiliar ao estudo dos ácidos nucleicos

26 Preparo do gel de agarose Preparar 1 L de tampão de corrida de gel (TBE 1x) TBE 50x 20 ml H 2 O q.s.q 1000 ml Preparar 100 ml de agarose 1%: agarose - 1g TBE 1x ml EtBr - 2 ml

27 Preparo do gel de agarose Pesar a agarose e colocar em um erlenmeyer. Acrescentar o tampão TBE 1x, tampar o frasco com filme PVC e fazer pequenos furos na tampa Levar ao microondas e aquecer até que toda a agarose esteja dissolvida (cerca de 1 minuto) Deixar esfriar até que a temperatura do frasco esteja suportável ao toque. *Adicionar o EtBr e misturar bem, ou *Mergulhar o gel em solução de bromento de etídeo após corrida eletroforética.

28 Preparo do gel de agarose Despejar cuidadosamente a agarose no suporte apropriado (com o pente já posicionado) evitando a formação de bolhas. Deixar esfriar completamente Retirar, cuidadosamente, o pente do suporte. Encaixar o suporte na cuba de eletroforese e adicionar o tampão de corrida (o mesmo utilizado para preparar o gel) em quantidade suficiente para cobrir o gel Lembre-se: a molécula de DNA tem carga negativa, portanto, migrará em direção ao pólo positivo.

29 Preparo da amostra para aplicação no gel Colocar na parede de um tubo eppendorf: Amostra - 5 ml Azul de bromofenol - 2 ml Marcador de peso molecular (Ladder 1Kb) Ladder - 1 ml Azul de bromofenol 2 ml H 2 O 4 ml Centrifugar por alguns segundos na microcentrífuga Aplicar amostras e padrão nas canaletas do gel com micropipeta. Fechar o sistema e colocar voltagem de 100v por cerca de 30 minutos

30 Visualização do resultado da eletroforese * Tem-se a opção de corar o gel após a corrida com brometo de etídio, ao invés de acrescentar o corante no próprio gel no momento da preparação: Preparar uma solução de brometo de etídio para coloração do gel: ml de água destilada - 30 ml de BrEt (solução pré preparada) Deixar o gel imerso nesta solução por cerca de 15 minutos. Visualizar o gel em transiluminador UV (com proteção de acrílico). Fotografar se necessário

31 Fatores que interferem na migração do DNA (ou de fragmentos de DNA) em géis de agarose Tamanho do DNA Conformação do DNA Concentração da agarose