Cronograma. Aula: Eletroforese (SDS-PAGE) e Sequenciamento de Proteínas Prática 6- Procedimento A (Diálise) Execução e Recolhimento do exerício 7

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1 Cronograma Entrega do Relatório 4 Entrega do Relatório 5 HOJE Aula: Eletroforese (SDS-PAGE) e Sequenciamento de Proteínas Prática 6- Procedimento A (Diálise) Execução e Recolhimento do exerício 7 23/10 (Prova de Protocolo + Execução e recolhimento Exercício 10) 30/10 06/11 Laboratório de informática Simulação computacional de purificação de proteínas Exercício de Sequenciamento 1

2 Tratamento da amostra (SDS + - mercaptoetanol) 100 C/5 min Coloração Descoloração Determinação da massa molecular Identificação e Sequenciamento da proteína Diálise Eletroforese (SDS-PAGE) Identificação e Sequenciamento de proteínas 2

3 Diálise Objetivo: Remover o excesso de sais (íons) que atrapalham nas etapas de caracterização da proteína. Antes da diálise Depois da diálise Proteínas Íons do tampão H 2 PO 4- /HPO 4 2- Na + /Cl - H 2 O Tampão fosfato 50 mm + NaCl 1 M (1 ml) H 2 O 2L Tampão fosfato mm NaCl 0.5 mm H 2 O 2L Tampão fosfato mm NaCl mm (diluição de 2000x) (diluição de 2000x) HOJE -Acrescentar 20 l de tampão de amostra - Incubar em água fervente por 5 min 23/ l de Tampão de Amostra: Tampão (Tris, ph 6.8) Glicerol SDS Azul de Bromofenol -mercaptoetanol 3

4 Outros métodos para separação da proteína Filtração sob pressão Ideal para desalinizar e concentrar amostras A amostra é forçada a passar através de uma membrana contendo poros de tamanho definido colocando-se o tubo em uma centrífuga Diálise Eletroforese (SDS-PAGE) Identificação e Sequenciamento de proteínas 4

5 Prática 6- SDS-PAGE 1) Receber o gel preparado e aplicar as amostras preparadas previamente Poço 1: Padrão de peso molecular Poço 2: Lisado centrifugado Poço 3: Material DEAE Poço 4: Padrão isolado de -galactosidase 2) Ligar a fonte 3) Eletroforese até o corante azul de bromo-fenol atingir a base do gel. Desligar a fonte. 4) Retirar o gel e colocar na solução de coloração (Azul de Coomassie) e depois na de descoloração. 5) Visualizar as bandas das proteínas. Identificar a -glicosidase. 5) Determinar o Peso Molecular. Eletroforese Eletroforese descreve a migração de uma partícula carregada sob influência de um campo elétrico. + + Mobilidade eletroforética: = v/e = Z/f Voet Velocidade de migração Carga Líquida v = Z E f Força do campo elétrico (V. cm -1 ) Coeficiente Friccional (resistência encontrada pelo íon; é afetado pelo tamanho/forma do íon) 5

6 Eletroforese - Aplicações -Acompanhamento de purificação de proteínas -Acompanhar expressão de proteínas -Isolar proteínas para análise por MS -Determinar o tamanho (Mr) da proteína Eletroforese em Gel PAGE do inglês polyacrylamide gel electrophoresis é o tipo de eletroforese mais utilizado para análise de proteínas 1. Uso de um campo elétrico 2. Uso de um polímero (poliacrilamida ou agarose) 3. Proteínas carregadas negativamente migram para o polo positivo 4. Migração depende da carga, massa, e formato das proteínas Gel é formado no espaço formado entre duas placas de vidro grapeados contendo espaçadores ( 1mm) Lenhinger 6

7 Fundamentos sobre a polimerização do gel de Poliacrilamida - Persulfato de amônio + TEMED: Formação de Radicais Livres iniciadores da polimerização TEMED S 2 O e- SO 4 Persulfato de Amônio TEMED - Radicais derivados do persulfato induzem a reação de polimerização dos monômeros de acrilamida e de bisacrilamida R + M RM RM + M RMM RMM + M RMMM, etc. Porosidade do gel é dado pela % da acrilamida [monômeros] determina o tamanho dos poros Tamanho do poro Ligações cruzadas (bis-acrilamida) Porcentagem de acrilamida: 5 %; 10 %, 15 %; 20 %; 30 % Polímero de acrilamida e bis-acrilamida Proteínas (SDS-PAGE) Gel serve como uma peneira 7

8 Tipos de Eletroforese Não-Desnaturante (Nativa) Eletroforese Separação por carga, peso molecular e forma Desnaturante (SDS-PAGE) Separação por peso molecular Agente Denaturante Torna a proteína carregada negativamente Proteínas reduzidas e desnaturadas com SDS apresentam a mesma velocidade de migração quando em eletroforese livre (sem o gel, somente tampão). v = Z E f SDS desnatura a proteína 1 SDS liga a 2 resíduos de aminoácidos + No entanto, quando em gel as proteínas são separadas segundo o seu peso molecular Resumindo: Em SDS-PAGE as proteínas são separadas basicamente pelo tamanho! 8

9 SDS-PAGE não redutor e redutor Eletroforese Não-Desnaturante (Nativa) Separação por carga, peso molecular e forma Desnaturante (SDS-PAGE) Separação por peso molecular Não-Redutora Redutora SDS Proteína SDS -mercaptoetanol Ou DTT Experimentos em SDS-PAGE não-redutor e redutor permitem observar a presença de dímeros e outras proteínas contendo pontes de disulfeto. 9

10 Gel de aplicação ou empilhamento Visualização de Proteínas após Eletroforese 1. Coloração com o corante (Coomassie blue, Prata) 2. Descoloração com ácido acético Lenhinger 10

11 Estimativa do Peso Molecular de Proteínas ( SDS Gel Electrophoresis) Mr D d Rm =d/d Mr = massa molecular (ou peso molecular) D= Migração total d = Migração individual de cada banda Lenhinger Métodos para determinar peso molecular SDS-PAGE Migração relativa Mr D d Precisão 5-10 % Rm =d/d Mr = massa molecular (ou peso molecular) Cromatografia de Exclusão Eluição relativa Precisão 10 % Espectrometria de Massas Método bastante sensível Fornece valores de PM com alta presisão Precisão % 11

12 Eletroforese em Gel-Bidimensional Objetivo: Maximizar a separação de proteínas (c) Eletroforese em gel bidimensional Primeira Dimensão Focalização isoelétrica Separa de acordo com o pi Segunda Dimensão SDS gel electrophoresis Separa de acordo com o tamanho Lenhinger 12

13 Focalização Isoelétrica 1. Eletroforese em gradiente de ph 2. Proteínas são distribuídas ao longo do gradiente de ph de acordo com o valor do seu pi. 3. Cada proteína é focalizada em uma faixa estreita de ph próxima ao seu pi Lenhinger Eletroforese em gel bidimensional das proteínas de E. coli - mais de 2,000 proteínas podem ser visualizadas Lenhinger Utilizada para comparar níveis de expressão de proteínas Proteínas de interesse podem ser identificadas utilizando-se anticorpos Proteínas são identificadas por espectrometria de massas 13

14 Diálise Eletroforese (SDS-PAGE) Identificação e Sequenciamento de proteínas O sequenciamento da proteína fornece informações acerca da estrutura primária Espectrometria de massas 14

15 A sequência de aminoácidos pode ser determinada pela sequência do DNA do gene que o codifica Proteoma No entanto, sequenciamento do gene NÃO: - Localiza pontes de disulfeto (S-S) - Identifica modificações pós-traducionais Genoma Sequenciamento de Proteínas 15

16 (a) Determinação da composição/proporção de aminoácidos: Hidrólise ácida (HCl 6 M) 1) hidrólise também pode ser realizada em meio básico, utilizando 2-4 M de NaOH 2) A hidrólise também pode ser realizada por digestão enzimática: Ex. Pronase (mistura de proteases) 3) A separação e análise dos aminoácidos pode ser feita por diversas técnicas como HPLC ou cromatografia em camada delgada (TLC). Fig 7-6 Separação e Análise de aminoácidos por HPLC. (Voet 3ed). Na TLC (thin layer chromatografy) os aminoácidos são revelados (p. ex. com nihidrina) e identificados utilizando-se padrões. (b) Identificação da extremidade amino-terminal utilizando: Reagente de Sanger (1-fluor-2,4-dinitrobenzeno, FNDB) 16

17 (c) Sequenciamento de toda a cadeia polipetídica: Degradação de Edman Fenilisotiocianato (PITC) Ácido trifluoracético (c) Sequenciamento de toda a cadeia polipetídica: Degradação de Edman Limitações: Tempo de análise longo Grande quantidade de amostra Atualmente o método de escolha para o sequenciamento tem sido a espectrometria de massas 17

18 Sequenciamento de proteínas grandes requer a clivagem parcial da cadeia polipeptídica (enzimas) 18

19 O sequenciamento dos peptídeos derivados da clivagem parcial da proteína pode ser feita por: -Degradação de Edman (técnica pouco usada atualmente) -Espectrometria de Massas (técnica mais utilizada atualmente devido a maior sensibilidade e especificidade do método) Identificação e Sequenciamento de Proteínas por Espectrometria de massas (MS) Aspectos históricos Apesar da espectrometria de massa ser utilizada a muito anos para o estudo de moléculas orgânicas, sua aplicação para o estudo de macromoléculas foi, por muito tempo, limitado por problemas técnicos. Macromoléculas como proteínas, DNA e carboidratos são fragmentados pelos processos necessários para ionizar as moléculas no vácuo do aparelho. Porém, com o advento de duas novas técnicas de ionização, isto mudou, e hoje a espectrometria de massas é uma ferramenta importante em biologia. 19

20 Requisito fundamental para análise no espectrômetro de massas Geração de íons em fase gasosa Mas como volatilizar uma macromolécula??? Nobel Prizes - Chemistry 2002 John B. Fenn is the chemist who invented the ELECTROSPRAY method (1988). Professor of Chemistry at Yale University, USA, and at Virginia Commonwealth University, USA Koichi Tanaka research engineer who developed the MALDI technique (1987). Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan. 20

21 Métodos de Ionizações Brandas Proteínas são ionizadas pela aquisição de prótons (íons c/ carga positiva) A carga é adquirida pela protonação de resíduos básicos da proteína (Lys, Arg) Massa da proteína [M + nh] n+ A ionização por electrospray produz proteínas carregadas com múltiplas cargas A ionização por MALDI produz proteínas monocarregadas Vantagens da utilização de espectrometria de massas A espectrometria de massas permite determinar a massa da proteína/peptídeo com alta precisão (<0.001%). A precisão de massa na eletroforese (SDS-PAGE) é de 5-10 %. É possível identificar proteínas através da análise das massas do peptídeos gerados (Peptide Mass Fingerprinting) e utilização de softwares que fazem a busca dos peptídeos detectados em banco de dados (p. ex. MASCOT) Ainda mais, é possível realizar o sequenciamento completo de cada peptídeo. Isso é importante para identificação de novas proteínas e de modificações póstraducionais. 21

22 Estratégias para a identificação de proteínas por espectrometria de massas Proteína Desconhecida Em geral a proteína é isolada de gel 2D... Digestão enzimática Mistura de Peptídeos Determinação da massa da proteína intacta por espectrometria de massas Determinação das massas de cada peptídeo por espetrometria de massas Match (proteína conhecida) Busca das massas dos peptídeos em Banco de Dados (PMF*) No Match (proteína desconhecida) Identificação e Caracterização da Proteína Sequenciamento de cada peptídeo por MS/MS Match (proteína conhecida) Busca das sequências em banco de dados de sequências (PFF**) No Match (proteína desconhecida) *PMF = Peptide Mass Fingerprinting; **PFF = Peptide Fragmentation Fingerprinting Caracterização de uma nova proteína Peptide Mass Fingerprinting (PMF) 22

23 Proteínas podem ser identificadas através das massas de peptídeos gerados na sua hidrólise por enzimas conhecidas. Os dados das massas dos peptídeos são colocados em um tipo de google para proteínas (ex. Mascot) Espetro de massa dos peptídeos gerados pela clivagem da proteína com uma protease Identificação de proteínas por peptide mass fingerprint (PMF) a) Busca em banco de dados de proteínas b) Comparação dos peptídeos detectados com os peptídeos teóricos obtidos na digestão de proteínas com a protease utilizada no experimento c) Match! Identificação. ex.: MASCOT Exemplo: Identificação da beta-glicosidase 23

24 Intens. [a.u.] 23/10/2012 Procedimento: Remoção da banda da -glicosidase, digestão com tripsina e análise por espectrometria de massas Tripsinização MALDI-TOF Obs. O protocolo de digestão utilizado inclui uma alquilação prévia dos tiois livres com iodoacetamida, x Espetro de massa dos peptídeos derivados da digestão da beta-glicosidase com tripsina Lista de peptídeos m/z detectados m/z

25 Busca no Mascot utilizando as massas dos peptídeos detectados Lista de peptídeos detectados m/z Modificações variáveis mais comuns Alquilação de tióis livres Durante o preparo da amostra para análise no espectrômetro de massa é comum realizar a redução de pontes de disulfeto (beta-mercaptoetanol ou DTT) e a alquilação do tiolato (SH livre) (p. ex. alquilação com iodoacetamide) 25

26 As massas detectadas são comparados com as massas teóricas da proteína através de softwares específicos (neste exemplo utilizou-se o Biotools da Bruker) Massas detectadas Massas teóricas RESULTADO OBTIDO NO MASCOT Scores acima de 86 são significantes (p<0.05) O score obtido na busca foi de 121. Portanto o resultado é signifiante. Parâmatros utilizados na busca pelo Mascot 26

27 Resultado do Mascot mostrando as sequências que tiveram match (em vermelho) O match ocorre quando a massa experimental bate com a teórica Massas que tiveram match Massas que não tiveram match. Essas massas podem ser de uma outra proteína ou de peptídeos que sofreram alguma modificação. Conclusões da busca no Mascot Os dados de análises dos peptídeos derivados da digestão tríptica da banda retirada do gel de eletroforese mostram que a proteína purificada corresponde à beta-glicosidase de Spodoptera Frugiperda. A cobertura da sequência foi de 23 % com um erro de 0.5 Da. É possível atingir uma cobertura maior usando erros maiores (47 % com um erro de 2 Da), porém isso pode levar à interpretações errôneas sobre a identificação da proteína. Apesar da cobertura ser aparentemente baixa, as sequências que foram cobertas (sequências que tiveram o match) possibilitam realizar a identificação da proteína com um score de 121. Esse score indica o grau de significância do resultado e para a busca realizada, scores acima de 86 são significantes (p<0.05). 27

28 Sequenciamento de peptídeos por espectrometria de massas Antigamente o sequenciamento era feito pela degradação de Edman. Atualmente o método de escolha é a espectrometria de massas. Peptídeos podem ser fragmentados no espectrômetro de massa A clivagem mais comum ocorre na ligação peptídica, gerando íons da série y e b. 28

29 Intens. [a.u.] 23/10/2012 Espectro MS/MS de um peptídeo b2-b1 = Phe (F) y2-y1 = Gln (Q) Lys (K) Glu(E) = = = Fonte: Wilson & Walker. Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology, 7ed. Capítulo 9, página Espectro de massa da mistura de peptídeos x Seleção e fragmentação de peptídeo (MS/MS) m/z Espectro de massa dos fragmentos de do íon de m/z

30 30/10/2012 (Turma A) 06/11/2012 (Turma B) LABORATÓRIO DE INFORMÁTICA 30