Cromatografia e suas aplicações em purificação de proteínas e peptídeos. Alexandre Rosolia Assessor Técnico - HPLC

Transcrição

1 Cromatografia e suas aplicações em purificação de proteínas e peptídeos Alexandre Rosolia Assessor Técnico - HPLC

2 1 - Cromatografia Líquida História e Evolução Alexandre Rosolia Assessor Técnico - HPLC

3 O que é a Cromatografia A Cromatografia é um método analítico de separação e quantificação de compostos em uma mistura.

4 Cromatografia Líquida P r i m e i r o e x p e r i m e n t o d e Cromatografia Líquida foi efetuado por Tswett em 1906, onde um extrato de folhas foi p e r c o l a d o c om diferentes solventes por uma coluna de vidro recheada com uma mistura de c arbonato de cálcio e alumina, até a separação do mesmo em faixas coloridas. Daí o nome Cromatografia ou E s c r i t a p o r C o r e s

5 Cromatografia Líquida Clássica Novos materiais tornaram a cromatografia líquida clássica uma técnica viável para separação e q u a n t i f i c a ç ã o d e substâncias, porém foi alcançado um patamar aonde somente a força da gravidade não é suficiente para percolar o solvente através das novas fases e s t a c i o n á r i a s.

6 Cromatografia Liquida de Alta Eficiência - HPLC Para superar a resistência das novas fases estacionárias com tamanho de partículas menores, o solvente é impulsionado por um sistema de bombeamento contínuo, a amostra introduzida através de uma válvula de amostragem e as substâncias após separadas são detectadas através de sistemas on-line completamente computadorizados, o qual interpreta os dados provenientes do sistema.

7 Cromatografia Liquida de Alta Eficiência - HPLC 125 UV Teste Sppedrod 002 Retention Time Name mau mau Minutes Cada pico corresponde à um componente presente na amostra. A área destes picos correspondem ao teor do componente.

8 2 - Instrumentação Cromatográfica Alexandre Rosolia Assessor Técnico - HPLC

9 Estrutura do Sistema Componentes: Bomba - Impulsiona a fase móvel pelo sistema Injetor de amostras - Coloca amostra no sistema Coluna - Aonde ocorre a separação da amostra Detector - Transforma a amostra em sinal elétrico Sistema de dados - Coleta de dados e controle do sistema

10 Bomba de HPLC

11 Bomba de HPLC

12 Cabeça da Bomba

13 Modo de Eluição GRADIENTE: Onde há alteração da composição da Fase Móvel ao longo do tempo de análise ISOCRÁTICO: Onde não há alteração da composição da Fase Móvel ao longo do tempo de análise Minutes

14 Sistemas de Gradiente Alta Pressão

15 Sistemas de Gradiente Baixa Pressão

16 Válvula Rheodyne

17 Válvula Rheodyne

18 Amostrador Automático

19 Amostrador Automático

20 Forno para Colunas

21 Detector UV

22 Detector DAD

23 Detector DAD

24 Detector de Condutividade

25 Coletor de Frações

26 3 -Técnicas de Separação Cromatográfica Alexandre Rosolia Assessor Técnico - HPLC

27 Mecanismos de separação para proteínas e peptídeos Exclusão de tamanho (SEC) Iônica (IEX) Afinidade Interação Hidrofóbica Fase Reversa (RP)

28 Exclusão de Tamanho (SEC) Conhecida também como Cromatografia de Filtração em Gel (GFC). Efeito de separação completamente físico. Utiliza-se resinas de porosidade controlada de acordo com a faixa de peso molecular desejado na eluição. A ordem de eluição é sempre da molécula mais pesada (excluída) para a molécula mais leve (permeada).

29 Exclusão de Tamanho (SEC)

30 Exclusão de Tamanho (SEC)

31 Exclusão de Tamanho (SEC)

32 Cromatografia de Troca Iônica (IEX) Técnica mais comum em purificação de proteínas A natureza anfótera das proteínas fazem elas adquirirem carga dependendo do ph do meio. A proteína é neutra no ponto iso-elétrico (pi). Em ph mais alto, ela é um ânion e em ph mais baixo, um cátion. A separação ocorre com a interação diferencial entre as cargas da proteína e da resina Após a proteína ser capturada pela resina iônica, pode-se eluir a mesma alterando o ph do meio ou sua salinidade, quando a proteína perde sua carga.

33 Cromatografia de Troca Iônica (IEX) Tradicionais Resinas Aniônicas Fortes TMAE Resinas Aniônicas Fracas DEAE DMAE Resinas Catiônicas Fortes SO - 3 SE Resinas Catiônicas Fracas COO -

34 Cromatografia de Troca Iônica (IEX) Fractogel Resinas Aniônicas Fortes TMAE Resinas Aniônicas Fracas DEAE DMAE Resinas Catiônicas Fortes SO - 3 SE Resinas Catiônicas Fracas COO -

35 Cromatografia de Troca Iônica (IEX)

36 Cromatografia de Troca Iônica (IEX)

37 Cromatografia de Afinidade A separação por cromatografia de afinidade ocorre com a interação reversível entre a proteína (ou grupo de proteínas) e um ligante acoplado à matriz da resina. A troca da condição de eluição (ph, salinidade ou polaridade) faz com que a proteína se desacople do ligante, assim eluindo para fora da coluna. Existem vários tipos de ligantes, desde interações covalentes até interações com anti-corpos específicos.

38 Cromatografia de Afinidade Fractogel Resinas de Afinidade Quelato para uso por afinidade metálica Amino para uso por afinidade por grupo NH 2 TA para uso por afinidade por adsorção tiofílica Epoxy para uso por afinidade por imobilização.

39 Cromatografia de Afinidade

40 Cromatografia de Interação Hidrofóbica RO RO RO O O N H N H H N O H N O OR OR OR Separa proteínas com diferenças nas áreas hidrofóbicas. A interação entre a resina e a proteína aumenta na presença de alta concentração de íons. A eluição ocorre diminuindo a concentração de sal no buffer. A força de ligação aumenta na seguinte ordem dos ligantes: éter, isopropil, butil, octil, fenil

41 Cromatografia de Interação Hidrofóbica

42 Cromatografia de Interação Hidrofóbica

43 Cromatografia de Fase Reversa A separação ocorre por diferença de hidrofobicidade entre a proteína e a fase ligada (normalmente C4, C8 ou C18). A eluição ocorre com o aumento da quantidade de solvente orgânico no buffer de (eluição em gradiente). Utilizada normalmente como estágio final de purificação de peptídeos e oligonucleotídeos. Técnica ideal para separação em escala analítica e scouting para escala preparativa.

44 Peptídeos em Fase Reversa O mecanismo de partição das moléculas pequenas não se aplica na cromatografia de proteínas e peptídeos. Estes são adsorvidos na fase estacionária até que uma concentração crítica de solvente orgânico entre na coluna e cause a desorpção. O mecanismo de Fase Reversa separa os peptídeos e proteínas baseado na diferença nas áreas hidrofóbicas das moléculas, isto é, diferenças de conformação e seqüência de amino-ácidos.

45 Cromatografia de Fase Reversa Gráfico de retenção x % de solvente orgânico na fase móvel. O mecanismo de partição tradicional mostra uma gradual perda de retenção conforme ocorre o aumento da % de solvente orgânico na fase móvel.

46 Cromatografia de Fase Reversa Gráfico de retenção x % de solvente orgânico na fase móvel. A retenção de uma proteína ou poli-peptídeo cai drasticamente com uma pequena variação da % de solvente orgânico na fase móvel. Após a desorpção, praticamente não existe interação entre a coluna e o analito.

47 Cromatografia de Fase Reversa Gráfico de retenção x % de solvente orgânico na fase móvel. A retenção de um peptídeo leve mostra um misto do mecanismo de partição e adsorção na coluna cromatográfica. Após a desorpção, ainda é possível controlar a retenção do analito.

48 Cromatografia de Fase Reversa

49 Cromatografia de Fase Reversa

50 Fase Reversa x Iônica

51 Influência da Polaridade da F.M. Por causa do mecanismo de adsorção / desorpção e do melhor controle do alargamento dos picos, trabalhar sempre com gradientes de solvente orgânico, mesmo que a diferença entre as condições inicial e final seja pequena.

52 Influência do Tempo de Gradiente

53 Influência do ph da Fase Móvel

54 Influência do tipo de Buffer

55 Influência da Temperatura

56 Influência do Tamanho de Poro A fase estacionária é extremamente porosa e a maioria dos sítios ativos da coluna encontram-se dentro dos poros. A proteína deve permear dentro destes poros para ser adsorvida e separada corretamente A escolha do tamanho de poro da coluna é crucial neste tipo de separação.

57 Fases Estacionárias

58 Coluna Monolítica

59 Influência do Tamanho de Poro

60 Influência do Tamanho de Poro

61 Colunas Wide-Pore

62 Peptídeos e Colunas Monolíticas

63 Peptídeos e Colunas Monolíticas

64 Influência da Carga de Amostra

65 4 - Purificação de Proteínas e Peptídeos por Cromatografia Preparativa Alexandre Rosolia Assessor Técnico - HPLC

66 Cromatografia Preparativa A cromatografia líquida foi desenvolvida originalmente como uma técnica de separação e quantificação de substâncias em uma mistura. Com o advento da separação, é possível alterar a escala do sistema cromatográfico para conseguir coletar grandes quantidades de substâncias puras, passando assim à um sistema de separação e purificação de materiais

67 Diferenças entre a cromatografia analítica e preparativa Objetivo da análise Tamanho de partícula Dimensão da coluna Razão Comp:Diam Formato dos picos Nr. de frações Fluxo Quantidade de amostra Sistema Analítico Seletividade e Eficiência de 2 à 10um < 5 mm 60:1 Gaussiano 10 ou mais < 10 ml/min < 1mg Sistema Preparativo Produtividade e Capacidade de 10 à 300um 10 à 1000 mm 4:1 Deformado até 5 de 10 a 1000 ml/min de g a Kg

68 Como transferir a separação Scale-up

69 Equação de Scale-Up X X 1 r r C = π π A 2 A P 2 P L X A - Fluxo na coluna Analítica X P - Fluxo na coluna Preparativa r A - Raio da coluna Analítica r P - Raio da coluna Preparativa C L - Razão Comprimento Preparativa Comprimento Analítica

70 Colunas Preparativas Dimensão da Coluna L / D ( mm) Fluxo (ml/min) Capacidade de Carga (mg) Volume de Carga (µl)

71 Scale-up - Exemplo Escala analítica Escala preparativa Coluna: 250 x 4 mm Fluxo: 1,5 ml/min Concentração: 5 mg/ml Volume de injeção: 20 ul π X X 1 A = r 2 r C A π P 2 P L Coluna: 250 x 50 mm Fluxo: 234 ml/min Concentração: 780 mg/ml Volume de injeção: ul Fator de escala: 156 x

72 Separação Preparativa

73 Etapa 1 Otimização da Separação D AD -C H n m S c o u t M i x g r a d p c t 5 m i n mau mau M in u t e s

74 Etapa 2 Estudo de Sobrecarga D AD -C H n m S c o u t 1 p c t u l D AD -C H n m S c o u t 1 p c t u l D AD -C H n m S c o u t 1 p c t 1 0 u l D AD -C H n m S c o u t 1 p c t u l mau mau M in u t e s

75 Etapa 2 Estudo de Sobrecarga D AD -C H n m S c o u t 1 p c t u l D AD -C H n m S c o u t 1 p c t u l D AD -C H n m S c o u t 1 p c t 1 0 u l D AD -C H n m S c o u t 1 p c t u l mau mau M in u t e s

76 Etapa 2 Estudo de Sobrecarga D AD -C H n m S c o u t M i x g r a d p c t 5 m i n D AD -C H n m S c o u t 1 p c t u l mau mau M in u t e s

77 Etapa 3 Transferência para o Sistema Preparativo P te s te p r e p mau mau M in u t e s

78 Etapa 4 Fracionamento dos picos e análise das frações 3000 P 311 teste prep mau mau Minutes

79 Etapa 4 Fracionamento dos picos e análise das frações P 311 teste prep mau mau Minutes

80 Etapa 5 Escolha das frações cromatograficamente puras

81 Etapa 6 Automação do processo de purificação Composto de interesse - Coletado

82 Sistema LaPrep

83 Sistema LaPrep Bombas de Fase móvel P110 Isocrática / Gradiente de alta e baixa pressão (até 3 solventes) Cabeças de bombeamento de 100, 250, 500 e 1000 ml/min Fácil mudança de escala Programável Controlada via Software Uso de mixer dinâmico

84 Sistema LaPrep Injeção de amostras Bomba de injeção de amostras P130 Cabeças de 10 e 50 ml/min Injetor manual Rheodyne Válvulas de injeção automatizadas Autosamplers opcionais

85 Sistema LaPrep Detectores Comprimento de onda fixo P310 Comprimento de onda variável P311 Multi-comprimento de onda P314 Índice de refração P320 Células intercambiáveis Opção para Fibra Óptica *

86 Sistema LaPrep Válvulas automáticas P202 Chaveadora 6 x 2 Injeção / troca de coluna / reciclo P206 Coletora de Fração 7 canais P212 Coletora de Fração 12 canais P216 Coletora de Fração 16 canais

87 Sistema LaPrep Software EzChrom Elite Plataforma única Controle integral sobre o LaPrep Sistema de aprendizado de coleta

88 Empacotador de Colunas Sistema completo com coluna, prensa e acessórios Opção de colunas encamisadas para aquecimento (forno) Custo operacional mais baixo que colunas prontas Diâmetros de 25, 50 e 100 mm Opera com qualquer fase estacionária

89 Empacotador de Colunas

90 Solventes Prepsolv Próprios para cromatografia preparativa Baixo resíduo de evaporação Custo mais baixo que a linha de solventes LiChrosolv Fornecimento em tambores para maior comodidade e automação em processos contínuos de purificação

91 Cromatografia e suas aplicações em purificação de proteínas e peptídeos Alexandre Rosolia Assessor Técnico - HPLC