PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS

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1 (>1000 proteínas diferentes) purificar -glicosilase PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS Métodos baseados nas diferentes propriedades das proteínas Carga, tamanho, hidrofobicidade, 0,92 U/mg interações específicas (estrutura 3a/ e 4a/) 100 U/mg Parâmetros úteis para acompanhar a purificação enriquecer a preparação em -glicosidase BQ EXPERIMENTAL: Precipitação com (NH 4 ) 2 SO 4 Diálise Cromatografia de troca iônica Diálise Eletroforese Inibidores da atividade enzimatica

2 FUNDAMENTOS DA ELETROFORESE -Eletroforese está baseada na migração de uma partícula carregada sob influência de um campo elétrico (biomoléculas possuem cargas que dependem do ph). + + Velocidade de migração: Mobilidade eletroforética: = q E f E v = q E f = v E = q f q= carga líquida E= Força do campo elétrico (Volts/cm) f= coeficiente friccional = 6 [resistência encontrada pelo íon; dependente da viscosidade do meio( ) e do tamanho e forma do íon, (r) ]

3 SUPORTES PARA ELETROFORESE Papel Gel de Agarose Manutenção do ph Gel de Poliacrilamida

4 ELETROFORESE E CROMATOGRAFIA SÃO DIFERENTES Mobilidade depende da carga e forma da molécula... Mobilidade depende das interações relativas da molécula (afinidade) com a fase estacionária e fase móvel...

5 Gel de Agarose SUPORTES PARA ELETROFORESE A agarose é uma mistura de polissacarídeos isolados de algas. Geis de agarose são muito utilizados para separações de moléculas particularmente grandes como ácidos nucleicos (DNA, RNA) s.jpg Ep/Electrophoresis.html

6 SUPORTES PARA ELETROFORESE Gel de Poliacrilamida O gel de poliacrilamida (PAGE) é preparado pela polimerização de acrilamida e bisacrilamida. Muito utilizado para análise de proteínas _Filling_1D_gel_wells_with_proteins_mixture.jpg 5a/Coomassie3.jpg

7 Eletroforese (SDS-PAGE) TIPOS DE ELETROFORESE DE PROTEÍNAS Nativa (não desnaturante) separação por carga, massa molecular e forma Desnaturante separação por massa molecular Interage com proteínas (~1SDS-2 aa resíduos) tornando-as lineares e carregadas negativamente Não Redutora + S-S - + S-S Redutora (-pontes-s-s- reduzidas com HS-CH 2 CH 2 OH ou DTT) SH SH SDS

8 SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) -Separa proteínas por TAMANHO!! Já que o SDS confere carga negativa homogênea a todas as proteínas = q f Figura Livro Stryer

9 SDS-PAGE -O SDS confere carga negativa à todas as proteínas Rath A et al. PNAS 2009;106:

10 SDS-PAGE 1) Preparo do gel 2) Preparo das amostras 3) Montagem do aparato de eletroforese 4) Aplicação das amostras 5) Separação das amostras no gel de eletroforese 6) Revelação do gel de eletroforese

11 PREPARAÇÃO DO GEL R + M RM RM + M RMM RMM + M RMMM, etc. Catalisador TEMED ou Riboflavina+luz malha de acrilamida e bisacrilamida serve como uma peneira para separação das proteínas

12 SDS-PAGE GEL DE EMPILHAMENTO Soluções Água SDS 10% Acrilamida/Bis-Acrilamida (30%) Tampão Tris 0,5 M ph 6,8 TEMED Persulfato de amônio Volume 3,05 ml 50 L 0,65 ml 1,25 ml 5 L 25 L v v v v 4 % Acrilamida Tampão ph 6,8 GEL DE SEPARAÇÃO Soluções Volume Água 4,02 ml SDS 10% 100 L 7-20 % Acrilamida Tampão ph 8.8 Acrilamida/Bis-Acrilamida (30%) Tampão Tris 1,5 M ph 8,8 TEMED Persulfato de amônio 3,33 ml 2,5 ml 5 L 50 L

13 No gel de Empilhamento... Direção da eletrofore Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Gly (pi=6,1) parcialmente dissociado em ph 6.8 (carga zero + carga -1) As proteínas se concentram em uma banda fina no gel de empilhamento aumentando a resolução) 4%acrilamida 7-20 %acrilamida ph=6.8 ph=8.8 Tampão Tris-Glicine No gel de Separação... Gly Gly Gly Gly Gly Direção Gly Gly Gly Gly da eletrofore Gly Gly Gly Gly Gly Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Gly (pi=6,1) Praticamente dissociado ph 8.8 (carga -1)

14 SDS-PAGE -Encaixar o gel no sistema de eletroforese -Colocar o tampão de corrida na parte superior e inferior do gel

15 2) Preparo das amostras TAMPÃO DE AMOSTRA (Laemmli buffer) Água Tampão Tris 0,5 M ph 6,8 Glicerol SDS 10 % Azul de bromofenol 0.5% -mercaptoetanol SDS-PAGE 3,55 ml 1,25 ml 2,50 ml 2,00 ml 0,20 ml 0,05 ml Ulrich Karl LAEMMLI, PhD Professeur emeritus University of Geneva Amostra dialisada e seca + 20 L Tampão de amostra Ferver/ 5 min

16 SDS-PAGE Aquecimento e SDS desnaturam a proteína Beta-mercaptoetanol reduz as pontes de dissulfeto -mercaptoetanol

17 SDS-PAGE Aplicar as amostras com cuidado! oad_a_sample_into_a_polyacrylamide_g el_electrophoresis_well.jpg 1: Padrão de peso molecular : Lisado centrifugado 3: Material DEAE

18 + - SDS-PAGE v = q E f = q f Ligar a fonte e aguardar a migração da proteína até o final - +

19 -Revelação do gel de eletroforese SDS-PAGE -Outros métodos de detecção: prata, anticorpos (immublotting) Antes de corar Após corar com azul de Coomassie e descorar p/remover o corante não ligado -Usos de SDS-PAGE -Acompanhar a expressão e/ou purificação de proteínas -Determinar massas moleculares de proteínas

20 DETERMINAR MASSA MOLECULAR RELATIVA Rm =d/d d= migração da proteína de interesse D= migração total

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22 ph 9 ELETROFORESE EM GEL BIDIMENSIONAL -Otimiza a separação de proteínas Primeira dimensão- separação de acordo com o pi Focalização isoelétrica Segunda dimensão- separação de acordo com a massa molecular ph 3 Prepara-se um gel com gradiente de ph. Aplica-se a mistura de proteínas. Cada proteína é focalizada em uma faixa estreita de ph próxima ao seu pi.

23 ELETROFORESE EM GEL BIDIMENSIONAL -Eletroforese em gel bidimensional das proteínas de E. coli -Utilizada para comparar níveis de expressão de proteínas -Proteínas podem ser identificadas por revelação com anticorpos. -Proteínas podem ser identificadas por espectrometria de massas. -Mais de 2,000 proteínas são visualizadas Proteínas de interesse podem ser identificadas utilizando-se anticorpos Proteínas são identificadas por espectrometria de massas