proteína purificada Proteínas: da extração à estrutura 3D Bioinformática I Passos necessários para estrutura 3D Julio Zukerman Schpector

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1 1BIT 768 BIOINFORMÁTICA IIgnez Caracelli & Julio Zukerman Proteínas: da extração à estrutura 3D Ignez Caracelli BioMat DF Bioinformática I Julio Zukerman Schpector LaCrEMM DQ UFSCar Passos necessários para estrutura 3D proteína purificada 2 1

2 Obtenção de proteína purificada extração ISOLAMENTO material de partida extrato bruto desintegração celular extração de enzimas solúveis e de membrana meio de extração? 3BIT 768 BIOINFORMÁTICA IIgnez Caracelli & Julio Zukerman proteína purificada Isolamento misturar, agitar, homogeneizar, sonicar Sobrenadante com Proteína solúvel células ou tecidos Pellets com células intactas, organelas, membranas e proteínas de membranas 4 2

3 5BIT 768 BIOINFORMÁTICA IIgnez Caracelli & Julio Zukerman extração isolamento PURIFICAÇÃO métodos e condições experimentais estratégia na purificação de enzimas. proteína purificada purificação 6 3

4 7BIT 768 BIOINFORMÁTICA IIgnez Caracelli & Julio Zukerman Separação de Proteínas Fracionamento: solubilidade da proteína depende da temperatura, ph, forca iônica Diálise Ultrafiltração Coluna cromatográfica Eletroforese Coluna cromatográfica reservatório amostra de proteína (fase móvel) matriz sólida porosa (fase estacionária) suporte poroso proteínas eluente caracelli-zukerman 8 4

5 9BIT 768 BIOINFORMÁTICA IIgnez Caracelli & Julio Zukerman Cromatografia filtração em gel leito de polímero poroso mistura de proteínas é adicionada à coluna cromatografia por exclusão de tamanho proteínas maiores correm mais rápido volume de amostra é limitado coluna usualmente longa moléculas de proteínas são separadas por tamanho; as moléculas maiores aparecem nas 1 as frações Cromatografia filtração em gel 10 5

6 Cromatografia de afinidade Separa proteínas por suas especificidades de ligação proteína de interesse ligante mistura de proteínas mistura de proteínas é adicionada à coluna contendo polímeros com ligantes específicos para a proteína de interesse solução de ligante 11 proteínas não-desejadas caracelli-zukerman deixam a coluna proteína de interesse deixa coluna com a solução de ligantes Cromatografia de afinidade 12 6

7 Purificação de uma enzima hipotética etapa volume (ml) proteína total (mg) atividade (unidades) atividade especifica (unidades/mg) extrato celular bruto precipitação com sulfato de amônio cromatografia de troca iônica cromatografia de gel filtração cromatografia de afinidade Purificação Fraction # fração número A280 A Peaks picos coletor de frações A280 perfil de eluição fração número Fraction # 14 7

8 extração isolamento purificação CONTROLE DA PUREZA Métodos de controle da pureza. Eletroforese QUANTIFICAÇÃO Métodos de quantificação de proteína. 15 ATIVIDADE Ensaios enzimáticos e fatores que governam a atividade catalítica. proteína purificada Controle da pureza 16 8

9 Eletroforese: SDS-PAGE Amostra catodo poço direção de migração proteínas migram de acordo com tamanho e forma a proteina é denaturada, as subunidades se separam anodo 17 Eletroforese: SDS-PAGE Amostra mistura de macromoléculas direção de migração eletroforese gel poroso 18 caracelli-zukerman 9

10 Eletroforese: corante Coomassie blue 4 subunidades 19 Eletroforese: curva de calibração proteína desconhecida Migração Relativa 20 padrões proteína desconhecida 10

11 Eletroforese: focalização isoelétrica para determinar pi da proteína utiliza anfolitos para obter um gradiente de ph proteínas param de migrar quando ph = pi 21 Eletroforese: focalização isoelétrica 22 11

12 Eletroforese: Focalização isoelétrica 23 Eletroforese: Focalização isoelétrica 24 12

13 Pontos isoelétricos de algumas proteinas proteína pepsina < 1,0 albumina de ovo 4,6 albumina de plasma sangüíneo 4,9 urease 5,0 -lactoglobulina 5,2 hemoglobina 6,8 mioglobina 7,0 quimotripsinogênio 9,5 citocromo C 10,7 lisozima 11,0 pi 25 extração isolamento purificação atividade quantificação controle da pureza 26 proteína purificada 13

14 ao final da purificação pool proteína pura ativa 27 concentração ~ 1 mg/ml proteína purificada ativa concentração ~ 1 mg/ml baixa quantidade concentração ~ 10 mg/ml ou mais quantidade ~ 30 mg 28 14

15 Métodos típicos para concentração.evaporação sob vácuo (cuidado com o tampão!!!).liofilização (cuidado com o tampão!!!!).diálise.filtração.centrifugação (centricon).eletroforese preparativa.retenção em suportes cromatográficos 29 isolamento e purificação concentração ( 30 mg/ml) proteína pura e concentrada experimento de cristalização 0 15

16 Por que a proteína cristaliza? precipitante PEG sais açúcares solventes orgânicos água Proteína ocorre se o processo for favorável do ponto de vista da termodinâmica os precipitantes removem água do meio forçando as moléculas a se associarem 31 (1) Cristal de proteína precipitação cristalização precipitado micro-cristais cristais 3D cristalização: ainda mais arte do que científica processo termodinâmico (o que se pensa entender) 2 16

17 Métodos para cristalização cristalização precipitação solubilidade da macromolécula diferem em suas cinéticas 33 Métodos para cristalização cristalização precipitação difusão de vapor (ca. 60%) MÉTODOS BÁSICOS diálise (ca. 20%) batch difusão em interface livre 34 17

18 DIFUSÃO DE VAPOR processo de equilíbrio entre duas soluções através da fase de vapor em um meio fechado graxa de vácuo lamínula gota (10 l) (proteína + precipitante) solução precipitante (1 ml) solução inicial menos concentrada (GOTA) perde solvente volátil = potenciais químicos 35 solução inicial mais concentrada (RESERVATóRIO) DIFUSÃO DE VAPOR lamínula gota (10 l) (proteína + precipitante) graxa de vácuo processo de equilíbrio entre duas soluções através da fase de vapor em um meio fechado solução precipitante (1 ml) V res >>> V gota equilíbrio atingido pressão de vapor difusão de espécies voláteis gota = reservatório (água ou solvente orgânico) 36 18

19 DIFUSÃO DE VAPOR processo de equilíbrio entre duas soluções através da fase de vapor num meio fechado "hanging drop" (gota pendurada) "sitting drop" (gota sentada) "sandwich drop" (gota em sanduíche) 37 Gota tradicional: lisozima tampão (precipitantes) 30% w / v PEG M NaCl 50 mm AcetatoNa ph 4,5 2 l lisozima (proteína) 100 mg/ml 50 mm AcetatoNa ph 4,5 2 l 4 l lamínula siliconada 38 19

20 Como crescer cristais? Começar com uma solução muito pura de proteína Criar uma solução supersaturada Esperar (minutos, dias, semanas, meses...) 9 Crescimento de Cristal de lisozima 0 20

21 Difusão de vapor: Hanging Drop largamente usado gota equaliza com o reservatório volume da gota diminui lentamente concentração da solução de proteina aumenta lentamente cristais reservatório gota [X] [Y] A1 A2 A3 A4 A5 A6 B1 B2 B3 B4 B5 B6 C1 C2 C3 C4 C5 C6 D1 D2 D3 D4 D5 D6 41 Difusão de vapor: Sitting Drop reservatório [X] [Y] A1 A2 A3 A4 A5 A6 B1 B2 B3 B4 B5 B6 C1 C2 C3 C4 C5 C6 D1 D2 D3 D4 D5 D

22 solubilidade energia G Fases da solução de proteína metaestável precipitação cristais supersaturação subsaturada crescimento e nucleação barreira de nucleação crescimento [Proteína] solução de proteína 43 Energia & Cristalização núcleos Agregados específicos Cristais proteína em solução Agregados não específicos tempo 44 22

23 Fatores que afetam o crescimento de cristais força iônica * íons específicos (Ca 2+ ) concentração da proteína * detergentes precipitante inorgânico ph* temperatura* tempo monodispersao* vibrações pressão *mais importantes gravidade pureza da proteina* accesso ao solvente* ligantes etc Experimentos iniciais de cristalização Banco de Cristalização Bioquímica Bancos de dados INFORMAÇÕES SOBRE A PROTEÍNA PRECIPITANTES TESTES DE PRECIPITAÇÃO 46 23

24 Cristal molécula cela unitária cristal 8 24

25 Montagem do cristal (a) (c) (d) (b) (e) 49 Cristal pronto para coleta de dados 50 25

26 Sistema Básico de Difração de Raio X feixe feixe difratado feixe incidente cristal detector 51 Coleta de Dados 52 caracelli-zukerman 26

27 Monocristal tubo de raio X raios X kv cristal chumbo feixe incidente feixe difratado detector de raios X 53 Cristalografia processamento de dados Estrutura: solução e refinamento fonte de RX difração melhora do feixe RX detecção 54 27

28 Difração de Raio X

29 Função densidade eletrônica densidade eletrônica amplitude medida fases associadas 57 Função densidade eletrônica densidade eletrônica amplitude medida amplitude medida Transformada de Fourier fases associadas densidade eletrônica 58 29

30 Mapa de densidade eletrônica mapa de densidade eletrônica o que você vê + o que você pensa = o que você obtém ajuste ao mapa de densidade eletrônica Resultado experimental = o que você vê 59 Resolvendo a estrutura dados obtidos ajuste 60 30

31 Resolvendo a estrutura ajuste 61 Resolução

32 Resolução A Resolução pior resolução 2.0 A 1.2 A melhor resolução 64 32

33 A obtenção da estrutura tridimensional (1) (2) (3) (4) 65 (5) 66 33

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35 A ligação peptídica aminoácido 1 aminoácido 2 R 1 R 2 ligação peptídica + N-terminal R 1 R dipolo - C-terminal 69 2 resíduos de aminoácido A ligação peptídica estrutura primária sequência de aminoácidos R O R C-terminal C N C C N C C C N C C N-terminal O R O R ligação peptídica

36 Verificação da qualidade: Gráfico de Ramachandran mesma proteína 1 1hbs 3,00 Å baixa resolução 2hbs - 2,05Å alta resolução Estrutura 3D Estrutura tridimensional = conhecer as coordenadas de todos os átomos 72 36