PRÁTICA: CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS

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1 CENTRO DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DISCIPLINA BIOQUÍMICA Profas. Roziana Jordão e Alexandra Salgueiro PRÁTICA: CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS I Objetivos Caracterizar a presença de proteínas; Verificar experimentalmente a precipitação de proteínas com e sem desnaturação; Relacionar as observações da prática com a teoria das propriedades de proteínas. 1 a PARTE COAGULAÇÃO DE PROTEÍNAS II Introdução O calor e o ph podem desnaturar a maioria das proteínas, uma vez que a agitação térmica e a força iônica influenciam as interações que equilibram a estrutura tridimensional dessas moléculas, podendo desestabilizar as pontes de hidrogênio, por exemplo. Cada proteína tem seu ponto isoelétrico e a coagulação será tanto mais rápida quanto mais próximo do ponto isoelétrico da proteína estiver o ph do meio. O leite contém proteínas importantes como caseína, lactoalbumina, e lactoglobulina, em proporções variáveis para cada espécie animal. Cerca de 85 % da proteína do leite de vaca, e cerca de 65 % da proteína do leite humano é caseína. O termo caseína abrange um grupo heterogêneo de proteínas que podem ser precipitadas do leite pelo abaixamento do seu ph normal (6,6-6,9) até ph 4,6. No leite in natura, as diferentes caseínas encontram-se associadas entre si, com o cálcio e outros íons formando micelas. A caseína é a principal proteína presente no leite e é bastante solúvel em água por se apresentar na forma de um sal de cálcio. Sua solubilidade é fortemente afetada pela adição de ácidos que, pela redução do ph, que reduz a presença de cargas na molécula, faz com que a sua estrutura terciária seja alterada e, conseqüentemente, levando-a à precipitação, como também a coagulação do leite. Essa redução de ph provoca a perda do cálcio, na forma de fosfato de cálcio, que é eliminado no soro. Quando se acidifica o leite, ocorre a precipitação das micelas provavelmente pela perda de cargas negativas importantes para sua estabilidade em solução, processo usualmente chamado de precipitação isoelétrica da caseína. III Procedimentos COAGULAÇÃO DO LEITE 1. transferir 10 ml de leite para um béquer de 100 ml; 2. adicionar aproximadamente 3,5 ml de solução de ácido acético 1 N, com agitação; 3. deixar em repouso por um minuto; 4. filtrar em tecido de algodão e espremer para eliminar toda a água; 5. transferir pequena porção do coágulo para um tubo de ensaio com ajuda de uma espátula ou bastão de vidro; 6. adicionar 4 a 6 ml de NaOH 0,1 N, suspendendo o coágulo; 7. especificar nesse tubo de ensaio, AMOSTRA D; 8. caracterizar a amostra D, isto é, a suspensão de caseína na etapa de Reação de Coloração.

2 INFLUÊNCIA DO ph E DA TEMPERATURA NA COAGULAÇÃO DE PROTEÍNAS 1. colocar 5 ml da amostra C em dois tubos de ensaio; 2. adicionar 1 ml de NaOH 0,1 0,2 N ao primeiro tubo (marcar com o lápis); 3. adicionar ao segundo tubo, 1 ml de solução tampão acetato a ph 4,7; 4. aquecer em banho-maria fervente por 5 min; 5. resfriar os tubos em água corrente; 6. observar e anotar os resultados. 2 a PARTE - REAÇÃO DE COLORAÇÃO II Introdução As proteínas são macromoléculas biológicas constituídas por aminoácidos unidos através de ligações peptídicas. Devido às ligações peptídicas e aos diferentes aminoácidos, as proteínas reagem com uma grande variedade de agentes químicos, formando produtos coloridos. Algumas reações são específicas para aminoácidos, sendo úteis na detecção e dosagem de proteínas. Outras reações caracterizam grupos comuns às proteínas em geral. A reação do Biureto pesquisa a presença de ligação peptídica. As proteínas e seus produtos de hidrólise que contenham a partir de duas ligações peptídicas, dão teste positivo. Os peptídios com menos de três resíduos de aminoácidos (com exceção da histidina) respondem negativamente. O reagente de Biureto é composto por sulfato de cobre em meio alcalino e a coloração violeta formada é proporcional às ligações peptídicas. Essa reação pode ser utilizada na dosagem de proteínas cuja representação do complexo formado está especificada abaixo: O = C C = O R C H O = C R C H polipeptídeo Cu ++ H C R C = O H C R polipeptídeo III Procedimento 1. Transferir 1 ml de cada amostra (A, B, C e D) para tubos de ensaio; 2. adicionar 1 ml do reativo do Biureto em cada tubo de ensaio; 3. observar e anotar os resultados.

3 3 a PARTE - REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO A natureza química das cadeias laterais dos aminoácidos que compõem a estrutura primária das proteínas determina as conformações das suas estruturas secundária e terciária. A solubilidade de uma proteína depende de algumas condições do meio: valor de ph, força iônica, temperatura e constante dielétrica. Em geral, as proteínas são menos solúveis no ponto isoelétrico; nesse valor de ph as proteínas não apresentam carga efetiva aparente (o número de cargas positivas é igual ao número de cargas negativas). Em valores de ph abaixo e acima do ph isoelétrico, as moléculas apresentam carga efetiva positiva e negativa, respectivamente; nesses casos, há menor tendência para agregação e precipitação, portanto maior solubilidade. A distribuição e proporção dos grupos polares (hidrofílicos) e dos apolares (hidrofóbicos) na molécula da proteína também influencia sua solubilidade. Muitas proteínas são solúveis em água ou soluções salinas devido aos grupos carregados positivamente e negativamente provenientes das cadeias laterais dos aminoácidos. As moléculas interagem umas com as outras, com pequenos íons de cargas opostas e com a água. Assim, ocorrem interações proteína-proteína, proteína-água e proteína-pequenos íons. Se a interação proteína-proteína é grande e a interação proteína-água é pequena, a proteína tenderá a ser insolúvel. Por outro lado, se a interação proteína-água é alta, a proteína tenderá a ser solúvel. Qualquer condição que aumente a interação proteína-proteína, ou diminua a interação proteína-água, diminui a solubilidade e vice-versa. As proteínas podem ser precipitadas de suas soluções por uma variedade de agentes, muitos deles com ação desnaturante. As proteínas formam sais de metais pesados em ph situado no lado alcalino do seu ponto isoelétrico; algumas proteínas combinam-se com zinco, cádmio, mercúrio, chumbo, dentre outros, formando proteinatos insolúveis. Alguns ácidos podem se combinar com proteínas que possuem carga elétrica, formando complexos insolúveis. O ácido tungstico (desproteinizante utilizado no preparo de filtrados isentos de proteínas) fornece íons negativos e precipita as proteínas positivamente carregadas. III Procedimento 1. Transferir 2 ml da amostras B ou C para um tubo de ensaio; 2. adicionar 0,5 ml de tungstato de sódio a 10 % ao tubo de ensaio (observar se houve precipitação); 3. adicionar 0,5 ml de ácido sulfúrico 2/3 no sistema em investigação; 4. homogeneizar; 5. observar e anotar os resultados. IV Referências HIRANO, Z. M. B. et al. Bioquímica Manual Prático. Blumenau: Edifurb, 2001, 173 p. MACEDO et al. Bioquímica Experimental. São Paulo: Livraria Varela. 2005, 187 p. STRYER, L. Bioquímica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan

4 CENTRO DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DISCIPLINA BIOQUÍMICA Profas. Roziana Jordão e Alexandra Salgueiro Aluno: Turma: Data: FIXAÇÃO DO APRENDIZADO DA PRÁTICA: CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS 1 Influência do ph e do calor na coagulação e solubilização de proteínas. Especifique a conclusão com justificativa. 2 Reação do Biureto Especifique a conclusão com justificativa. 3 Precipitação com ácido tungstico Especifique a conclusão com justificativa

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