PURIFICAÇÃO PARCIAL DOS ANTICORPOS PRESENTES NO SORO NORMAL ATRAVÉS DA PRECIPITAÇÃO DA FRAÇÃO GAMA- GLOBULINA COM SULFATO AMÔNIO

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Oswaldo Geraldo de Lacerda Casqueira
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1 PURIFICAÇÃO PARCIAL DOS ANTICORPOS PRESENTES NO SORO NORMAL ATRAVÉS DA PRECIPITAÇÃO DA FRAÇÃO GAMA- GLOBULINA COM SULFATO AMÔNIO Priscila Diniz Lopes Doutoranda em MV, área de concentração Patologia Animal Março/2015

2 Proteínas Macromoléculas compostas por aminoácidos, com ligações covalentes entre si, podem ser polares ou apolares, de acordo com o ph, devido à distribuição elétrica resultante das ligações covalentes ou iônicas de seus grupos estruturais Constituintes do soro Diferem entre si estruturalmente e participam em vários processos fisiológicos Anticorpos, carreadores de moléculas e íons, enzimas, inibidores enzimáticos, fatores da coagulação

3 Proteínas Uma cadeia de aminoácidos, unidos entre si por ligações peptídicas Grupo amino Grupo carboxil Grupamento Lateral Identidade

4 Proteínas Combinação de diferentes aminoácidos, bem como a quantidade de aminoácidos presentes em uma molécula de proteína, confere a ela peso e carga elétrica distinta Albumina: mais abundante (60%), uma das menores moléculas proteicas Função: transporte de diversas substâncias e manutenção da pressão oncótica B-globulina: compostas por um grupo heterogêneo de proteínas: beta-lipoproteínas, transferrina e componente C3 do complemento Função: transporte triglicerídeos e colesterol hidro insolúveis pela circulação sanguínea, transporte de ferro e mediador em numerosas reações imunes

5 Proteína Y-globulina: fração constituída por imunoglobulinas (Ig s), com destaque à IgG Função: envolvidas na resposta imune humoral a-1-globulina; a-2-globulina

6 Purificação de anticorpos Método de isolamento: Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas: 1. Tamanho Massa Densidade (ex: centrifuação, diálise, gelfiltração) 2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese) 3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa) Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas moléculas: 4. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que interage é um reagente de fácil obtenção, disponível comercialmente) Finalidades terapêuticas e profiláticas, além de diagnósticos

7 TÉCNICA Purificação parcial dos Acs presentes no soro normal através da precipitação da fração Gama-Globulina com sulfato de amônio Objetivo: separar a fração Gama e Beta Globulina do soro utilizando a solução saturada de sulfato de amônio Principio: método não específico de purificação de anticorpos baseado no fracionamento físico-químico

8 Técnica Precipitação com sais neutros: sulfato de amônio e o sulfato de sódio Sulfato de amônio a 40% de saturação Salting-out: maior interação proteína-proteína, diminuição da solubilidade em meio aquoso e, consequentemente, precipitação da proteína

9 Técnica + 5 ml 5 ml Calcular a quantidade da solução de sulfato de amônio a 100% de saturação X= V x C C

10 Técnica Volume da solução de sulfato de amônio Deixar agitando rpm por 8

11 Técnica Descartar o sobrenadante Ressuspender em sulfato de amônio a 42% ; volume de água 30 ml X= V x C C Ressuspende em 1 ml de PBS 1º solução salina 2º PBS 2 dias a 4º C 2 trocas

12 DESCRIÇÃO Juntar 5ml de soro com 5ml de P.B.S. Calcular o volume de sulfato de amônio a l00% de saturação que deverá ser acrescentado a mistura de soro mais P.B.S. no volume final de l0ml; volume de sulfato de amônio a l00% de saturação onde: V - volume final de soro - PBS C - A saturação do sulfato de amônio desejado (40%) X= V x C C Sob agitação cuidadosa, acrescentar gota a gota o volume calculado do sulfato de amônio a l00% de saturação, para dar uma saturação final de 40%. Continuar agitando por mais 30 minutos. Transferir o volume para os tubos de centrífuga e levar a centrífuga a 3000rpm por l5 minutos. Após a última lavagem, descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1 ml de PBS com cuidado e com o uso de pipeta Pasteur. O sedimento resuspenso deve ser colocado dentro do saco de diálise, esse deve ser fechado e se coloca para dialisar contra salina. Deixa-se dialisar por 2 dias a 4ºC, com duas trocas de líquido de diálise ao dia. Retira-se a fração precipitada do saco de diálise e guarda-se em congelador a -20ºC para ser testada por imunodifusão / imunoletroforese.

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