EXTRAÇÃO, SEPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO ENZIMÁTICA

Transcrição

1 EXTRAÇÃO, SEPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO ENZIMÁTICA EQB4383 _ Enzimologia Industrial

2 Etapas de Extração, Separação e Purificação Enzimáticas remoção de material insolúvel separação dos produtos purificação e polimento (geralmente associado a cristalização) Remoção de material insolúvel, separação do sólido e líquido - a filtração e a centrifugação Separação de produtos - a adsorção e a extração por solvente. A obtenção de enzimas intracelulares a partir de microrganismos necessita de técnicas de lise celular, que abrangem métodos físicos, químicos e enzimáticos.

3 Métodos enzimáticos: baseiam-se na digestão da parede microbiana catalisada por enzimas, tais como: lisozima (bactérias), glucanase, tripsina e protease (leveduras). -pouco aplicados em escala industrial em função dos altos custos das preparações enzimáticas e das enzimas terem que ser removidas depois. Métodos químicos: tratamento com bases (NaOH): tem aplicações limitadas -valores elevados de ph; choque osmótico: variação da concentração de soluto presente no tampão - não pode ser usado em bactérias Gram positivas, pois estas tem elevada pressão osmótica interna; tratamento com detergentes: laurilsulfato de sódio, triton, - dissolvendo membrana. tratamento com solventes orgânicos: álcool isopropílico, etanol. Métodos mecânicos Congelamento / descongelamento: formação de cristais de gelo intracelulares, enzimas susceptíveis ao congelamento podem ser inativadas; moagem com abrasivos: é feita em moinhos vibratórios com esferas de vidro, necessitando de sistema de resfriamento para absorver o calor gerado no processo; cisalhamento líquido sob alta pressão: passagem por pequenos orifícios sob alta pressão - múltiplas etapas e com cuidados para não elevar a temperatura; sonificação: realizado em aparelhos de ultrassom é muito empregada em laboratório.

4 Concentração Tamanho, carga, hidrofobicidade, solubilidade e atividade biológica são as principais características proteicas utilizadas na etapa de purificação das proteínas.

5 Precipitação Isoelétrica: Solubilidade das proteínas em relação ao ph

6 - Precipitação com sais inorgânicos (Salting-out) -

7 % Proteína Precipitada A concentração ótima de sal requerida para precipitação deve ser determinada experimentalmente e geralmente varia entre 20 e 80% da saturação % Saturação Distribuição típica das proteínas frente a precipitação com (NH 4 ) 2 SO 4

8 Precipitação com solventes orgânicos Precipitação com polímeros

9 Ultrafiltração Uma membrana semi-permeável permite a separação das moléculas de solvente das moléculas enzimáticas grandes porque apenas as moléculas pequenas podem penetrar na membrana quando a pressão osmótica é excedida. As principais vantagens da ultrafiltração como etapa de concentração são: utiliza baixas pressões hidrostáticas; não ocorre mudança de fase; não utiliza reagentes químicos; mantém força iônica e ph da solução concentrada; evita desnaturação e inativação das enzimas. As dificuldades advém da concentração por polarização, formação de camadas de géis na membrana ou por fouling (deposição) na membrana.

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11 Liofilização Resulta na concentração dos sais presentes na solução inicial, obtida a enzima na forma ativa em forma de pó, esta é muito mais estável do que em solução aquosa. O uso de tampão fosfato não é recomendado e aplicação de aditivos como lactose, trealose e manitol (1-5%) é de grande utilidade.

12 ETAPA DE PURIFICAÇÃO Cromatografia de Gel-filtração Também conhecida como permeação em gel, exclusão por tamanho ou peneira molecular. Este é um método utilizado para o fracionamento e purificação de proteínas sendo, também, aplicável à determinação de seus pesos moleculares. O processo de gel-filtração pode ser definido como a partição difusional das moléculas de soluto entre a fase móvel, constituída pelo solvente, e a fase estacionária formada pelos poros do gel.

13 Troca-iônica

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15 Cromatoenfoque

16 Adsorção Na adsorção, os componentes da amostra serão retidos ou não sobre a superfície da fase estacionária que é constituída por substâncias que apresentam campos de forças não neutralizados ou valências livres, permitindo a atração e a retenção das partículas sobre sua superfície por forças do tipo Van der Waals, ligações hidrogênio ou interações eletrostáticas. Afinidade

17 Interação hidrofóbica

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19 Eletroforese Baseia-se na existência de grupos ionizáveis nas moléculas biológicas (proteínas, ácidos nucleicos, peptídeos, aminoácidos, etc.) e, portanto, quando em solução podem existir como espécies eletricamente carregadas separação pela mobilidade das proteínas ocasionada por um campo elétrico. A eletroforese em papel é o meio mais simples e mais usado na separação de uma vasta gama de produtos carregados. Em alguns casos, não se obtém uma boa separação. Na eletroforese em gel, o uso de géis, como amido, agarose e poliacrilamida, como meio de suporte permitiu um aumento na resolução das amostras. A relevação do gel de proteína pode ser feito empregando-se substâncias específicas como Comassie Brilliant Blue, Bromofenol ZnSO 4 ácido acético ou Nitrato de prata.

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22 Custos associados a purificação da enzima

23 ETAPA DE FORMULAÇÃO - As preparações enzimáticas podem ser comercializadas sob a forma sólida ou líquida, sendo para isso necessário que esta permaneça totalmente ativa pelo tempo em que esteja estocada e transportada. - Os estabilizantes tem como exemplos NaCl, (NH 4 ) 2 SO 4, albumina, scarose, glicerol, PVA (polivinilalcool), PVP (polivinilpirrolidona), PEG (polietilenoglicol) e CMC (carboximetilcelulose). - O preparado enzimático sob a forma sólida é obtido por secagem a vácuo ou por atomização (spray-dryer).