CORREÇÃO DE EXERCÍCIOS 1-9

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1 CORREÇÃO DE EXERCÍCIOS 1-9 Ex 1 a) O músculo cardíaco é rico em mitocôndrias onde se localiza a citrato sintase. Essa enzima é a primeira enzima do ciclo de Krebs e é fundamental para a produção de ATP necessário à contração muscular. O extrato é mantido em gelo para minimizar reações degradativas e processos de desnaturação que podem elevar à inativação da enzima. O tampão, ph 7,2 contendo sacarose mantém o homogenato em condições de ph e osmolaridade próximas às fisiológicas. b) Com a centrifugação diferencial se consegue, dependendo da velocidade, separar desde tecidos não rompidos e debris até organelas celulares. c) A adição de concentrações crescentes de sal vai levando à precipitação de proteínas numa ordem que dependem do conteúdo de regiões hidrofóbicas expostas ao solvente que possuam. As proteínas que possuem mais regiões hidrofóbicas precipitam it a menores concentrações de sal, porque este furta as móleculas de água que foram forçadas a interagirem com regiões hidrofóbicas. Estas então interagem, agregando-se. Assim, diferentes concentrações de sal foram adicionadas para separar as proteínas segundo sua hidrofobicidade e enriquecer o conteúdo de citrato sintase do homogenato. Ex 1, continuação. d) A diálise é feita, justamente, para retirar o excesso de sal. O ph é mantido para manter a estrutura da proteína. e) A citrato sintase deve ter um alto PM porque está na primeira fração protêica que elui na cromatografia por exclusão. A absorção de luz a 280 nm é adequada para monitorar a presença de proteínas porque resíduos aromáticos, principalmente triptofano e tirosina, absorvem luz a 280 nm. f) O bioquímico está explorando o fato de que a carga líquida de uma proteína varia com o ph. Adicionando um tampão de ph mais elevado, ocorre a desprotonação de resíduos da proteína e sua interação com a coluna de troca catiônica diminue, permitindo sua eluição da coluna. 1

2 Ex 2. Descreve três métodos para dosar CH DNS-Açúcares redutores Glicose e Frutose GO-Enzimático específico Glicose FS-Hidrólise: di,tri, polisacarídeos -Apresenta uma tabela obtida com diferentes linhagens de cana de açucar para decidir qual seria a melhor para obter sacarose. Qual o melhor método para o teste? O único método que pode ser utilizado é o FS porque a sacarose é um dissacarídeo (estrutura abaixo). Como explica os resultados da tabela? Confirma o colocado acima. Só o método do FS forneceu resultados experimentais consistentes. Ex. 2, continuação. Calcule a concentração de açúcares solúveis nos homogenatos e a quantidade de açucar que pode ser obtida por g/tecido. Qual a melhor linhagem para obter sacarose? Ex. de cálculo- Eq da reta- 0,812= 0,0212x + 0,0104 Amostra 1- x= 37,8 ug Usados 100 ul de amostra- [0,38 ug/ul]= [38 mg/ml]-vt=10 ml 380 mg 380 mg sacarose em 10 g tecido 38 mg/g Abs Curva padrão FS y= 0, ,0104 R 2 =0, micrograma amostra açucar solúvel/ massa de cana

3 l l l 4/10/2011 Ex 3. Para selecionar a linhagem de levedura que produz mais -glicosilase a partir de sacarose que método usar para dosar a enzima a partir da sacarose como substrato? Dinitrosalicílico (DNS) porque mede açúcares redutores Não redutor G+F redutores Ex g leveduras de diferentes linhagens ml de lisado -Mediu atividade id d -glicosilase il com p-nitrofenilglicosídeo il li -Mediu concentração de proteínas -Construiu uma curva padrão com BSA Qual a concentração de atividade enzimática no lisado de cada linhagem? Ex 4, continuação- Determinação da velocidade de formação de produto Curva padrão da apostila, pg 7: y=0,0061x + 0,0097 (A x nmol) Ex. A-A420 a 15 min = 0,050 0,050= 0,0061x+ 0,0097 6,6 nmoles A B C D E F Velocidade de formação de produto exemplos nmo nmo nmo 3

4 Ex 4, continuação- Determinação da concentração de atividade enzimática no lisado; atividade por g/tecido mu [atividade enzimática] atividade total V 10 ml 1g tecido A B C D E F Ex 4, continuação- Determinação da concentração de proteína em cada um dos lisados e suas atividads específicas. curva padrão m (ug) Abs original A B C D E F X10 409,1 0,400 X 20 20,0 108,75 158,83 1,88 9,40 26,60 8,24 98,30 4

5 Ex 4, continuação- Qual das linhagens é melhor para produzir a enzima em larga escala? Linhagem B (>atividade enzimática/g tecido) Se for necessário purificar qual a melhor fonte? Linhagem D > maior atividade específica (< número de etapas de purificação). Ex5. Homogenato 80 mu/ml e 80 mu/mg 1,5 ml- aplicado em um coluna DEAE-celulose ( coletados 1,0 ml material DEAE) com maior atividade α-glicosidase (tubos 14, 15, 16)) Dosa atividade (A) Dosa proteína (B) (A) atividade enzimática (mu/ml) A) 3,7 nmole/min = 3,7 mu/50 µl 74 mu/ml 5

6 Ex 5, continuação -Dosagem proteína (B) DEAE ABS 595nm 0,01 ml X fora da reta 0,04 0,13 8 µg/tubo 0,2 mg/ml 0,05 0,1510 µg/tubo 0,2 mg/ml 0,1 0,35 X fora da reta C) Atividade específica 74 mu/ml e 0,2 mg/ml 370 mu/mg D) Recuperção- inicial= 15mlde80mU/ml(120 1,5 mu/ml mu) = 61.7 % enzima total final = 1,0 ml de 74 mu/ml (74 mu) E) Enriquecimento- inicial= 80 mu/mg final= 370 mu/mg = 4.6 Ex 6. Perfil de eluição da alfa-glicosidase em DEAE (+) a diferentes phs pi ph= 9,0, enzima bastante retida -- negativamente carregada ( E ) ph= 8,0, enzima bastante retida mas elui c/ baixa [NaCl] - (E) ph= 6,0, enzima não retida 0 + pi<8 e 6 ( E ) ou ( E ) 6

7 Ex 7. Purificação de uma celulase por cromatografia de troca iônica e filtração em gel sendo dados a quantidade de material aplicado e a correspondente atividade enzimática a) Recuperação? b) Atividade específica (500 U/1 mg) (100 U/0.02 mg) (100 U/0.05mg) 05mg) (80 U/0.02mg) c) Qual seria melhor? Filtração em gel que levou a uma celulase de maior atividade específica com boa recuperação. Ex 7, continuação- Calcule a massa molecular por SDS-PAGE (1,4 cm) Migração relativa = migração individual) = migração total (bromofenol (4,3 cm) 4,7 B y=-1,0189x + 4,98 Data1B PM (kda) (log) Migração relativa log PM 4,6 4,5 4,4 4,3 4,2 PM= (4,65) 0,32 31 (4,49) 0,47 23 (4,36) 0,65 14 (4,15) 0,79 Celulase (4,48) 0,49 4,1 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 migração relativa 7

8 Ex 7, continuação- Calcule a massa molecular por filtração em gel PM 7, ? K av = (V eluição -V 0 ) (exclusão) (V t -V 0 ) 25 PM (kda) ( log) v.eluição(ml) Kav 66 (4,8155) 9,38 0, (4,6532) 10,46 0,168 12,4 (4,0934) 13,70 0,353 6,5 (3,8129) 16,22 0,497 Celulase (4,7737) 9,58 0,1173 4,8 4,6 B y=-2,6274x+ 5,0820 Linear Fit of DATA1_B PM log PM 4,4 4,2 4,0 3,8 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Kav Ex 7, continuação- d) A massa molecular determinada por flitração em gel (~ Da) foi 2X a massa determinada por SDS-PAGE (~30.000). Isso indica que a enzima nativa é um dímero de 2 subunidades de ~ Da. De fato, na filtração em gel a proteína está no estado nativo, enquanto que em SDS- PAGE a proteina é desnaturada em presença de SDS que rompe ligações hidrofóbicas, e no caso de gel redutor, tb as ligações dissulfeto. SDS PAGE ~30 ~30 Filtração em gel Tampão de amostra ~30 ~30 8

9 Ex 8. Dado o perfil de eluição da alfa-glicosidase (pi= 7,0) em DEAE (+) a ph= 8,0, esboçar os perfis de eluição a ph= 4,0 e 9,0). ph= 4,0 ph= 9,0 3 unidades de ph abaixo pi 2 unidades de ph acima pi (E+++ ) (E- -) Abs 420nm [NaCl] tubos Ex 9. A proteína que é eluída após a adição de sal é a proteína A. Pode-se concluir isso analisando o perfil da solubilidade das proteínas função do ph. A proteína A e proteína B tem solubilidade mínima em ph 3,0 e 6,0, respectivamente. Como, no geral, a solubilidade é mínima perto do pi (carga líquida= zero e portanto menor repulsão entre as moléculas) podemos concluir que as proteínas A e B tem pi de 3,0 e 60 6,0, respectivamente. t Assim, numa mistura dessas proteínas a ph = 6,0, a proteína A terá carga de ~-3 e a B terá carga ~0. Assim numa coluna de troca aniônica (trocadora de ânions; carga +) a proteína B não interage com a coluna enquanto que a proteína A interage e só eluirá com a adição de tampão contendo NaCl. 9

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