RESOLUÇÃO DO EXERCÍCIO 2 - Bioquímica Experimental QBQ 0316N Vitor Medeiros Almeida

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1 RESOLUÇÃO DO EXERCÍCIO 2 - Bioquímica Experimental QBQ 0316N Vitor Medeiros Almeida Exercício 2: Calcule a concentração de atividade enzimática no lisado de cada uma das linhagens de levedura. Calcule também a atividade obtida por grama de células. Calcule a concentração de proteína em cada um dos lisados e a atividade específica de cada um dos materiais. Se o próprio lisado for utilizado industrialmente como fonte de enzima, qual das linhagens é melhor para produzir essa enzima em larga escala? Se for necessário purificar a enzima, qual das linhagens é a melhor fonte? Justifique as respostas. Primeiramente, para vermos a atividade enzimática de cada uma das linhagens, esqueceremos as diluições (por enquanto). Focar somente na parte final da tabela. A atividade da enzima é medida através da detecção do p-nitrofenolato que é liberado do substrato quando a enzima o cliva da glicose. Então, quanto mais p-nitrofenolato liberado/tempo, maior a atividade da enzima. Fazendo gráficos com esses números teremos curvas de Abs x tempo, mas o que nos interessa aqui é nmol p-nitrofenolato x tempo. Usaremos uma curva padrão de p-nitrofenolato da apostila de prática para fazer essa conversão.

2 Utilizando esta equação da reta y= x + 0,014, transformaremos os valores de absorção da tabela, por valores de nmol de p-nitrofenolato, substituindo o y pelos valores de absorção obtidos. Teremos então a seguinte tabela. Linhagem 15min 30min 45min 60min A B C D E F nmol pnitrofenolato Linhagem A y = x R² = Minutos Se fizermos todos os gráficos no Excel (nmol x tempo), teremos as seguintes equações de reta: A y=0.6802x B y= x C y= x D y= x E y= x F y=1.0204x Nessas equações, o valor que multiplica x (y=ax + b), representa o quanto do eixo y muda, para cada variação de 1 unidade no eixo x. No caso dessas retas, significa quanto de nmol de p- nitrofenolato é liberado em cada minuto de reação. Usando de exemplo a linhagem A { y=0,68x 2,86}, em cada minuto, aumenta 0,68 nmol de p- nitrofenolato, logo a atividade é 0.68nmol/minuto. Outra forma de obter esse valor que multiplica o x (a) sem ter que usar o Excel, é através de Δy/ΔX (a variação de y dividido pela variação de x). Usando e exemplo a linhagem A Enquanto o eixo y varia { 37,95-7,34}, o eixo x varia {60-15}, resultando em 30,61/45 = 0.68.

3 Faz-se a transformação para umol/min (x10-3 ) para calcular a atividade específica posteriormente. Linhagem nmol/min umol/min U A B C D E F Agora que já temos as atividades de cada linhagem, devemos calcular a concentração da atividade enzimática ( atividade por ml), e a atividade por g de célula. Usando a Linhagem B como exemplo para o cálculo de atividade/ml de lisado: Nós calculamos que a linhagem B tem atividade de 0,00109 U. Porém, para chegar nesse valor, foi usado somente 20 ul do lisado. Então temos uma simples regra de 3 0, µl z µl z = 0,054 Porém, para chegar nesses valores de Abs., também houve uma diluição prévia de 50 vezes, então devemos multiplicar esse valor por 50 0,054*50 = 2,7. Então, a Linhagem B tem 2.7 U/ml. Fazendo a mesma coisa para as outras linhagens, temos: Linhagem U U/ml A B C D E F

4 Para calcular a atividade/g de célula, temos que nos atentar que esses valores obtidos estão por ml de lisado, e o exercício nos deu as amostras com 1g para cada 10 ml do lisado. Logo, é só multiplicar os valores encontrados por 10. Linhagem U/ml U/ml/g A B C D E F A atividade específica de uma enzima é a atividade por grama de proteína, então o próximo passo é ver a quantidade de proteínas em cada linhagem. A linhagem B é a linhagem que resulta em maior quantidade de atividade enzimática por grama de material inicial. Portanto, ela é a melhor linhagem para se extrair enzimas. CÁLCULO DE PROTEÍNA POR LINHAGEM Primeiro passo é fazer a equação da reta da curva padrão de albumina. mg proteina abs

5 y = x R² = Substituindo o y por cada valor de absorbância obtido nas linhagens, temos: Linhagem abs mg proteína A B C D E F Levando em consideração as diluições (fazendo o mesmo tipo de conta que foi feito nas diluições para a atividade enzimática), temos, usando como exemplo a linhagem A: 0,0065 mg/100ul 0,065mg/1ml (1000ul). Multiplicando por 20 (o quanto foi diluído), temos 0,065*20=1,3mg/ml. Fazendo o mesmo para todas as outras: Linhagem mg/ml A 1.31 B 19.9 C 2.49 D 0.63 E 9.38 F 8.28

6 Notar que as atividades foram obtidas por ml, e a concentração de proteínas também está em ml, então, para cálculo da atividade específica, deve-se somente dividir a atividade pela [proteína]: Linhagem [proteína] Ativ. Espec. U/ml mg/ml (U/mg) A B C D E F A linhagem D é a linhagem que resulta em maior atividade específica. Esta linhagem, portanto, é a que deve ser utilizada para se obter a enzima mais pura (atividade enzimática por mg de proteína).