Laboratório de Análise Instrumental

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1 Laboratório de Análise Instrumental Prof. Renato Camargo Matos

2 PRÁTICA 12: Determinação de paracetamol e cafeína em medicamentos por HPLC Objetivo: Determinar as concentrações de paracetamol e cafeína usando a cromatografia líquida de alta eficiência com detecção ultra-violeta. Método físico-químico de separação, no qual os constituintes da amostra a serem separados são distribuídos entre duas fases. Uma estacionária e de grande área (fase estacionária) e a outra um fluído insolúvel que flui na primeira fase (fase móvel). Durante a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, os componentes da mistura são distribuídos pelas duas fases de tal forma que cada um deles é seletivamente retido pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais dos componentes. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) Emprega uma fase móvel (FM) líquida e uma fase estacionária (FE) muito finamente dividida 3 a 10 µm em colunas fechadas e com diâmetros internos normalmente de 4 a 6 mm. Para se obter vazões satisfatórias o líquido deve ser pressurizado a altas pressões.

3 Cromatografia líquida com fase ligada à sílica A FE é retida na sílica por meio de ligação química. É o método mais utilizado, pois apresenta maior estabilidade da coluna. reação de um organoclorosilano com grupos hidroxilas formados na superfície das partículas formando um organosilano. Natureza dos grupos funcionais da fase estacionária FASE NORMAL FE polar e FM relativamente não-polar FASE REVERSA FE não-polar e FM relativamente polar Ex. Coluna C-8 (grupos octil [-C 8 H 17 ]) Colunas de Fase Reversa (RPC): eficientes, estáveis reprodutitivel, detecção muitas vezes é mais fácil.

4 Tempo de retenção SEPARAÇÃO DE AMOSTRAS IONIZÁVEIS POR FASE REVERSA Quando um ácido (HA) ou uma base (B), não carregados, sofre ionização forma-se uma espécie muito menos hidrofóbica - mais hidrofílica. HA H + + A - H + + B BH + Hidrofóbico (Maior Retenção) B (pka 1,5) A Hidrofílico (Menor Retenção) paracetamol cafeína pka = 9,5 pka = 13 A pka = 4 Fase Móvel: mistura de H 3 PO 4 ph 2,5 e Metanol (60:40) ph Limitação da coluna: 2 < ph < 8

5 Procedimento experimental Massa da amostra Ultra-ssom -10 min Balão volumétrico (10 ml) 20,0 mg de medicamento H 3 PO 4 ph 2,5 H 3 PO 4 : MetOH (40:60) H 3 PO 4 ph 2,5 H 3 PO 4 : MetOH (40:60) Filtro de membrana PTFE 0,45 mm resíduo filtrado Alíquota ( 320 L) Balão volumétrico (10 ml) HPLC

6 Valores de áreas e tempos de retenções obtidos para injeção no HPLC-UV das soluções padrões da curva analítica. T. de Retenção (min) Analito Cafeína Paracetamol Curva analítica Concentração (mg L -1 ) Cal 1 Cal 2 Cal 3 Cal 4 Cal 5 Cal 1 Cal 2 Cal 3 Cal 4 Cal 5 Área (mua.s) Valores de áreas e tempos de retenções obtidos para injeção no HPLC-UV das amostras. T. de Retenção (min) Analito Cafeína Paracetamol n Amostras Área (mua.s) Concentração (mg L -1 )

7 TRATAMENTO DOS DADOS Construa a curva analítica no software do HPLC e imprima os relatórios da curva analítica (Concentração mg/l X área mua) e das análises das amostras de acordo com a diluição realizada, expressando a concentração em mg/g de comprimido. Determine as concentrações dos analitos e o intervalo de confiança ( = 0,05) na amostra do medicamento e compare o resultado obtido com valor do fabricante.