Métodos Eletroforéticos de Análise

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1 1 Métodos de Separação - Análise QUALI e QUANTITATIVA de substâncias. Métodos Cromatográficos -Cromatografia em papel -Cromatografia em camada delgada -Cromatografia em fase gasosa -Cromatografia em fase líquida Métodos Eletroforéticos -Eletroforese Capilar -Eletroforese em Microchips -Eletroforese em gel -Eletroforese bi-dimensional Métodos Eletroforéticos de Análise Mecanismos de Separação: Eletroforese Capilar em Solução Livre 2 Eletroforese Capilar - Definições 3 Técnica de separação baseada nas diferentes velocidades de migração apresentadas pelos analitos, quando submetidos à ação de um elevado campo elétrico. Técnicas de Eletromigração em Capilares: Família de técnicas que empregam campo elétrico na separação e/ou na movimentação dos analitos em sistemas capilares. Terminology and Nomenclature in Capillary Electroseparation Systems Knox, H. J.; J. Chromatogr. A 1994, 680, Terminology for Analytical Capillary Electromigration Techniques Riekkola, M. L.; Jönsson, J. A.; Smith, R. M.; Pure Appl. Chem. 2004, 76(2),

2 4 Eletroforese em Capilares Eletroforese em Microchips Eletroforese em Gel Focalização Isoelétrica Eletroforese Bidimensional Aplicações 5 bjetivos - Compreender o funcionamento do mecanismo de separação relacionado à separação eletroforética em solução livre. - Compreender os efeitos no fluxo eletrosmótico, a dependência do potencial elétrico aplicado e os métodos de determinação. - Diferenciar os termos: mobilidade aparente, mobilidade eletroforética e mobilidade eletrosmótica. - Diferenciar os termos: polaridade normal e polaridade invertida. - Familiarizar com a instrumentação básica. Eletroforese Capilar 6 Detector Controle Capilar Fonte de Alta Tensão Tampão Amostra L T = cm Tampão 2

3 nal do Detector (U.R.) Fluxo Eletrosmótico (EF) 7 Fluxo Laminar (pressão) EF 8 Eletroforese Capilar 1,3 1,2 1,1 1, Tempo (min) Mobilidade Eletroforética 9 n plug capilar l (comprimento até o detector) L (comprimento total) Detector s v t l v t m 3

4 tempo de migração (min) nal (U.R) Efeito do Potencial Aplicado 10 2,0 Ca 2 Na Mg2 K Li 1,5 5,0 kv 1,0 7,5 kv 0,5 10 kv 0,0 20 kv -0,5 25 kv Tempo (min) Mobilidade Eletroforética 11 v l t m V v ee e L (1) (2) Combinando-se (1) e (2), temos: l t m V e L e ll t V m t m ll V e Tempo de Migração Potencial (kv) 4

5 Corrente (A) Quanto maior o potencial, mais rápida a análise? U = R x i y = ax b a = 1/R Potencial (kv) Controle de Temperatura 14 Efeito Joule Dispersão (s 2 ) 15 Efeito Joule Decréscimo no campo elétrico Efeito proporcional na geração de calor Reduz a eficiência e resolução Redução do diâmetro do capilar Decréscimo significativo na corrente Diminui a sensibilidade Pode causar aumento na adsorção Decréscimo na concentração do tampão Decréscimo proporcional da corrente Pode causar aumento na adsorção Controle ativo da temperatura Termostatos; remoção de calor do capilar 5

6 Fluxo Eletrosmótico (EF) Estrutura da sílica fundida H lanol isolado H lanóis vicinais H - lanol dissociado loxano H lanóis geminais H 16 Fluxo Eletrosmótico (EF) Fenômenos Eletrocinéticos 17 Eletrosmose Potencial de fluxo (streaming potential) ldham, K. B.; Myland, J. C.; Fundamentals of Electrochemical Science, Academic Press, San Diego, CA, USA, Fluxo Eletrosmótico (EF) 18 IHP HP CAPILAR H H H H H - - H H - PC (z ) 6

7 Resposta (UR) 12,5496 8,4888 Resposta (UR) 41, , Alguns parâmetros... tm2 tm 1 R 2 w1 w2 N t m 16 wb 2 t m2 t m1 w b1 w b2 20 0,35 0,30 Exemplo 1 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 w b1 = 7,35 w b2 = 9, Tempo (s) 21 0,35 0,30 Exemplo 2 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 w b1 = 3,56 w b2 = 4, Tempo (s) 7

8 Resposta (UR) 27,972 18,9 22 0,30 0,25 Exemplo 03 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 w b1 = 5,11 w b2 = 7, Tempo (s) Fluxo Eletrosmótico (EF) 23 Fatores que afetam o EF ph (z) Potencial Aplicado (E) Concentração (ou Força Iônica) do Tampão (z) Temperatura (h) Solventes rgânicos (h, e, z) Modificação da Superfície do capilar Aplicação de um potencial radial externo Fluxo Eletrosmótico (EF) 24 Fatores que afetam o EF ph EF / 10-4 cm 2 V -1 s -1 8

9 Fluxo Eletrosmótico (EF) 25 Fatores que afetam o EF Concentração EF / 10-8 m 2 V -1 s Como medir o EF? 26 nal de um marcador Neutro Monitoramento da corrente que flui pelo capilar ll eof t V eof Polaridade Normal 27 CAPILAR H H H H H - - H H - 9

10 28 Eletroforese Capilar Detector Controle Capilar Fonte de Alta Tensão Tampão Amostra L T = cm Tampão Polaridade Normal 29 CAPILAR H H H H H - - H H - 30 Eletroforese Capilar - Técnica de separação baseada na diferença de mobilidade (velocidade) de compostos iônicos ou ionizáveis sob ação de um campo elétrico. v ep E ep ze 6hr 10

11 eof a = 0 Mobilidade Aparente 31 a ef eof a > 0 ef eof a ef a eof a < 0 ef Análise de Cátions 32 a ef eof Após uma análise eletroforética, a mobilidade aparente de uma espécie catiônica foi igual a 1,610-4 cm 2 V -1 s -1. Considerando o valor de eof = 1,010-4 cm 2 V -1 s -1, calcule o valor da mobilidade eletroforética da espécie analisada. Análise de Ânions 33 a ef eof a < 0??? 11

12 Fluorescência (URF) Fluorescência (URF) Fluorescência (URF) Fluorescência (URF) Análise de Ânions 34 0,4 0,3 0,2 0,1 Poliéster-toner Fluxo Normal app = ep eof 0,6 0,4 0,2 eof FL ep 3,0x10 Poliéster-toner Fluxo Invertido 4 CM 5 1,0 x10 ap??? 0, Tempo (s) 0, Análise de Ânions 35 0,4 0,3 Poliéster-toner Fluxo Normal 0,6 FL Poliéster-toner Fluxo Invertido 0,2 app = ep eof 0,4 CM 0,1 0,2 0, Tempo (s) 0, Eficiência da Separação 36 N t m 16 wb 2 0,3 0,2 Toner preto (Imp. Monoc.) 2,0 1,5 Toner preto (Imp. Colorida) 1,0 0,1 0,5 0, Tempo (s) 0, Tempo (s) 12

13 Resolução 37 tm2 tm 1 R 2 w1 w2 1 R 4 N _ t m2 t m1 w b1 w b2 1 R 4 2 V _ D EF 1/2 Seletividade (a) 38 utros fatores que afetam a seletividade: -EF -Temperatura -Composição do tampão -Adsorção à parede do capilar Tampão: Borato 100 mm; Capilar 25 m, 17 cm até o detector; Potencial 30 kv; Detecção UV em 200 nm. Instrumentação Básica 39 Fonte de Alta Tensão D Pt Reservatórios 13

14 360 m Instrumentação Básica 40 Capilares Materiais: Sílica Fundida, PTFE, PEEK Comprimento: 20 a 70 cm Diâmetro Interno: 20 a 75 m Fonte de Alta Tensão Potencial: 0-30 kv Corrente: 400 A Potência: 12 W 75 m Controle de Temperatura Injeção de Amostra Detecção Coleta de Frações Injeção da Amostra 41 A introdução da amostra no capilar pode ser feita de duas maneiras: Aplicando-se pressão ao capilar Injeção Hidrodinâmica Pressão positiva ou negativa Gravidade Utilizando-se campo elétrico Injeção Eletrocinética Injeção da Amostra 42 Injeção Hidrodinâmica da Amostra (Pressão) P P 4 Pr t V 8hL V : Volume Injetado P : Gradiente de Pressão r : Raio do capilar t : Tempo de Injeção h : Viscosidade L : Comprimento do Capilar 14

15 Injeção da Amostra 43 Injeção Hidrodinâmica da Amostra (Gravidade) 4 rghr t V 8hL h V : Volume Injetado r : Densidade g : Aceleração da Gravidade h : Diferença entre os níveis r : Raio do capilar t : Tempo de Injeção h : Viscosidade L : Comprimento do Capilar Injeção da Amostra 44 Injeção Eletrocinética da Amostra Fonte AT Vctr Q 2 ep eo L Q : Quantidade de Material Injetado c : Concentração r : Raio do Capilar t : Tempo de Injeção ep : Mobilidade Eletroforética eo : Mobilidade do FE L : Comprimento do Capilar Injeção da Amostra 45 Desvios na Injeção Eletrocinética da Amostra (Sample Bias) t 0 = 0 E K Na H

16 Injeção da Amostra 46 Desvios na Injeção Eletrocinética da Amostra (Sample Bias) t 1 > 0 E K Na H 2 0 Introdução 47 Detecção Direta ou Indireta?? Métodos Ópticos 48 16

17 Absorção UV-vis 49 b I o I T I I 0 A log T ebc Absorção UV-vis 50 Absorção UV-vis 51 Detecção UV-vis mono-canal 17

18 Absorção UV-vis 52 Detecção UV-vis mono canal - Exemplos Absorção UV-vis 53 Detecção UV-vis multi-canal Absorção UV-vis 54 Detecção UV-vis multi-canal - Exemplos 18

19 Absorção UV-vis Detecção UV-vis multi-canal - Exemplos 55 Eletroforese em Microchips 56 L T = 3-5 cm Eletroforese em Microssistemas 57 19

20 58 59 Exemplos 60 20