Métodos de Purificação de Proteínas Nativas
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- Daniela Weber Canejo
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1 Métodos de Purificação de Proteínas Nativas Disciplina: Métodos de Análise e Purificação de Proteínas Prof. Dr. Marcos Túlio de Oliveira Créditos a Ms. Flávia Campos Freitas Vieira e Prof. Pisauro.
2 Métodos de Purificação de Proteínas 1. Trabalhando com proteínas; 2. Purificação Proteica; 3. Métodos Cromatográficos; 4. Análise de Proteínas.
3 Trabalhando com Proteínas Compreensão sobre estrutura e função de proteínas proteínas individuais; Separadas de outras de forma pura, para a determinação de suas propriedades; Proteína pura essencial para que suas propriedades e atividades sejam determinadas.
4 Trabalhando com Proteínas SEMPRE! trabalhar com proteínas em baixa temperaturas (0 a 4ºC)!!! Usar tampão correto (ph, cofatores, estabilizadores, etc.)
5 Trabalhando com Proteínas Como purificar uma proteína Métodos clássicos Diferença de propriedades das proteínas: carga, tamanho, ligantes. Métodos modernos Clonagem de DNA, sequenciamento genômico, chips de proteínas, etc.
6 Trabalhando com Proteínas Proteína nova precedentes estabelecidos e bom senso. Mais de um método de purificação utilizado. Levar em consideração métodos descritos para proteínas semelhantes. Iniciar com métodos de baixo custo.
7 Estratégia Geral para Obtenção da Proteína Extração Purificada Isolamento 1. Material de Partida Extrato Bruto 2. Desintegração celular Separação Fracionamento Solubilidade Tamanho Carga Afinidade Ligação Diálise Ultra filtração Coluna Cromatografica
8 Purificação Proteica: Fonte Proteica
9 Purificação Proteica: Isolamento Extrato Bruto
10 Material Duro Agitação com pequenas partículas (beads) French Press
11 Material Mole Choque osmótico Transferência rápida de uma solução isotônica para uma solução hipotônica. Devido a osmose as células ficam túrgidas provocando a lise da membrana. Ruptura por tratamento químico Usa-se solvente orgânico ou detergente para romper diferentes tipos de tecidos, células e organelas. Ex: álcalis, solventes, detergentes e ácidos.
12 Vamos começar a purificação!
13
14 Centrifugação diferencial Centrifugação diferencial é usada para separar organelas, pedaços de membranas e citosol (fração solúvel do citoplasma) do extrato celular.
15 Purificação Proteica: Fracionamento Fracionamento Separação das proteínas do extrato em diferentes frações com base no tamanho, carga. Diferenças na solubilidade proteica Função do ph, temperatura, concentração de sais e outros fatores.
16 Purificação Proteica: Fracionamento Salting out Precipitação proteica com elevada concentração salina. ((NH 4 ) 2 SO 4 ) sulfato de amônio A adição de um sal na quantidade correta pode precipitar algumas proteínas e manter outras em solução
17 Purificação Proteica: Preparação Solução proteica passa por modificações para uma purificação eficiente. Diálise: separa proteínas de pequenos solutos se aproveitando do maior tamanho das proteínas. Ex: Remoção de sulfato de amônio da amostra.
18 Métodos Cromatográficos Cromatografia em Coluna Poderoso método de fracionamento. Diferença de tamanho, carga, afinidade de ligação e outros. Velocidade da migração depende da propriedade da proteína.
19 Lehninger, 5ª ed. 2010
20 Métodos Cromatográficos Tipos de Cromatografia em Coluna: o Troca Iônica (Aniônica e Catiônica); o Gel-filtração ou Exclusão por tamanho; o Afinidade; o Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC).
21 Cromatografia de troca iônica Baseado nas diferenças de sinal e magnitude da carga elétrica líquida de proteínas em um dado ph. Resina: o Trocadora de cátions (grupos aniônicos); o Trocadora de ânions (grupos catiônicos).
22 Cromatografia de troca iônica Afinidade afetada: o ph (determina o estado de ionização da molécula); o concentração dos íons dos sais livres que competem na solução circundante.
23 Cromatografia de troca catiônica Matriz carregada negativamente. Proteínas com carga líquida positiva migram mais lentamente. Expansão da solução proteica na fase móvel: o separação de proteínas com diferentes propriedades o espalhamento difusional. Lehninger, 5ª ed. 2010
24 Cromatografia de troca catiônica Tamanho da coluna aumenta, a resolução de dois tipos de proteínas com cargas líquidas também aumenta. A velocidade da solução proteica diminui com o tamanho da coluna. Quanto mais devagar a solução proteica gasta na coluna, a resolução diminui (espalhamento difusional).
25 Cromatografia de exclusão por tamanho Ou gel-filtração. Separação por tamanho. Fase sólida: grânulos de polímero com ligações cruzadas, com poros de tamanho específico. Proteínas grandes saem da coluna antes que as pequenas.
26 Cromatografia de exclusão por tamanho Proteínas grandes não entram nas cavidades e são eluídas mais rapidamente. Enquanto proteínas menores percorrem um caminho maior dentro dos poros. Lehninger, 5ª ed. 2010
27 Cromatografia de afinidade Baseado na afinidade de ligação. Resina: ligante (grupo químico covalentemente ligado). Proteínas com afinidade se ligam ao ligante. Lehninger, 5ª ed. 2010
28 Cromatografia de Afinidade Pequenas proteínas são ligadas aos suportes e a mistura complexa de proteínas é aplicada Proteínas ligadas podem ser eluídas com moléculas pequenas ou reagentes
29 Formado um complexo entre proteína e ligante. As proteínas que não se ligam são lavadas da coluna. Proteína de interesse é eluída com uma elevada concentração de sal e do ligante livre. O sal interfere nas ligações iônicas que ligam a proteína ao ligante. O ligante livre se liga a coluna de afinidade. Lehninger, 5ª ed. 2010
30 Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) Bombas de alta pressão aceleram o movimento de moléculas de proteína através da coluna. Reduzindo o tempo de trânsito na coluna, a difusão de bandas é diminuída e a resolução aumentada.
31 Como analisar o resultado da purificação? (como visualizar proteínas e determinar a pureza da amostra?) Absorbância 280nm SDS-PAGE
32 A280
33 A280
34 Eletroforese de Proteínas Géis de polímero de acrilamida - poliacrilamida. Migração afetada pela massa-carga e forma da proteína.
35 Eletroforese de Proteínas Contribui com grande carga negativa. SDS (sodium dodecyl sulfate) desdobra parcialmente as proteínas, assumindo forma semelhantes.
36 SDS-PAGE Ação do SDS
37 Eletroforese de Proteínas Vantagens Método analítico: útil tanto separar quanto visualizar proteínas. Estimar rapidamente o número de diferentes proteínas presentes em uma amostra ou o grau de pureza. Permite determinação do ponto isoelétrico e massa molecular aproximada.
38 Eletroforese de Proteínas Separação, quase exclusivamente, pela massa molecular. Polipeptídeos menores migram mais rápido. Visualização com Coomassie ou Nitrato de Prata. Aproximação da massa molecular para proteínas desconhecidas.
39 Eletroforese Bidimensional Combinação sequencial da focalização isoelétrica e SDS-PAGE. Separação de mistura complexa proteica. Mais sensível que os métodos isolados. Massa molecular e pi.
40 Resumindo... Proteínas são separadas e purificadas com base nas diferenças de suas propriedades. Proteínas podem ser seletivamente precipitadas por mudanças no ph ou temperatura e, particularmente, pela adição de certos sais. Métodos cromatográficos faz uso de diferenças de tamanho, afinidades de ligação, carga e outras propriedades Todos os procedimentos de purificação exigem um método para quantificação ou análise da proteína de interesse na presença de outras proteínas.
41 Proteina X Citoplasmática Peso molecular (616,487 g/mol) Caráter ácido Possui calda poli His
42 Proteina X Coletar o material Romper a membrana celular para liberação do EXTRATO BRUTO Centrifugar Descartar as partes que não serão utilizadas e manter as partes utilizáveis Utilizar métodos cromatográficos (Ni-Sepharose)
43 Próxima aula: Métodos de Purificação de Proteínas Recombinantes
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