Purificação de Proteínas

Transcrição

1 Purificação de Proteínas

2 Recuperação da atividade enzimática Etapa de purificação 100 mu 80 mu 2ml de lisado contendo 50 mu/ml 10ml de material contendo 8 mu/ml Recuperação = 80% = 80 mu/100 mu Recuperação: indica qual a porcentagem de atividade enzimática recuperada após o procedimento de purificação

3 Recuperação em relação ao início etapas Recuperação de 90% em cada etapa

4 100 U de alfa-glicosidase 1 mg de proteína 100U/mg 100 U de alfa-glicosidase 2 mg de proteína 50U/mg 100 U de alfa-glicosidase 10 mg de proteína 10U/mg

5 Enriquecimento 100 mu/mg Etapa de purificação 200 mu/mg Enriquecimento = 2 = 200/100 Enriquecimento: indica o aumento da atividade específica após o procedimento de purificação.

6 Propriedades usadas na purificação de proteínas através de cromatografia líquida Na separação a amostra contendo a mistura de proteínas é preparada em solução aquosa, a solução é colocada em contato com um suporte sólido poroso (fase estacionária) e eluída através deste suporte com uma solução aquosa (fase móvel). A separação ocorre devido a diferenças entre as propriedades das diferentes proteínas. Propriedades exploradas: Tamanho (massa molecular) Carga líquida Polaridade (hidrofobicidade) Afinidade química (especificidade)

7 Sistema para FPLC amostra Coluna cromatográfica Detector UV 280nm Coletor de frações

8 Filtração em Gel ou Cromatografia de Exclusão Molecular Tamanho: 20 kd 100 kd Fluxo de solução tamponante através da coluna abs280 volume

9 5 µm

10 fluxo

11 fluxo volume

12 Seletividade As dimensões dos poros da matriz determinam a faixa de peso molecular das proteínas que podem ser separadas na cromatografia.

13 Tipos de resina Sephacryl (dextrana + bis-acrilamida) 50 µm Sepharose (dextrana + epiclorohidrina) µm

14 Cálculo de peso molecular relativo utilizando cromatografia de filtração em gel Definições v e = volume de eluição da amostra (proteína de interesse) v o = volume morto ou void. Volume no qual são eluídas proteínas totalmente excluídas dos poros das resinas. Corresponde ao volume externo aos grãos da resina v t = volume total da coluna. Pode ser calculado geometricamente a partir das dimensões da coluna.

15 v o = volume morto ou void. Volume no qual são eluídas proteínas totalmente excluídas dos poros das resinas. Corresponde ao volume externo aos grãos da resina Pode ser medido usando macromoléculas muito grandes, em geral blue dextrana (milhões de Daltons)

16 v e = volume de eluição da amostra (proteína de interesse)

17 v t = volume total da coluna. Pode ser calculado a partir das dimensões da coluna.

18 Definições razão de eluição K av = (v e v o )/(v t -v o ) Log PM K av

19 Cromatografia de Troca Iônica Carga líquida: Aminoácidos possuem cadeias laterais ionizáveis; Proteínas possuem terminais C e N ionizáveis. pi (ponto isoelétrico) = ph no qual o número total de cargas positivas é igual ao número total de cargas negativas. Logo, a proteína não tem carga líquida. Se o ph > pi, a carga líquida da proteína é negativa Se o ph < pi, a carga líquida da proteína é positiva

20 + - Fluxo de solução tamponante com ph definido

21 - + Fluxo de solução tamponante com ph definido volume

22 Fluxo com solução tamponante contendo NaCl NaCl - Na + Cl - Na + Cl - Na + Cl - Cl - Cl - + Na + Cl - Na + Cl - Na + Cl- Cl - Na + volume

23 + pi = 7 pi = 9 ph = F α q1.q2

24 NaCl +++ volume + +++

25 Tipos de resina

26 Cromatografia de Hidrofobicidade Polaridade: Adição de sal

27 Série de Hofmeister Cátions: NH 4+ > K + > Na + > Li + > Mg +2 > Ca +2 > guanidina Efeito precipitante Ânions: SO 4-2 > HPO 4-2 >acetato>citrato>tartarato> Cl - > NO 3- > SCN -

28 Adição de sal Precipitação por sulfato de amônio é usada para concentrar e/ou purificar parcialmente amostras contendo proteínas

29 (NH 4 ) 2 SO 4 Fase estacionária apolar Abs 280 volume

30 (NH 4 ) 2 SO 4 Abs 280 volume

31 Abs 280 volume

32 Tipos de resina

33 Cromatografia líquida de fase reversa Polaridade: (Material poroso apolar é a fase estacionária) 1 o. 2 o. Eluição: aumento da % de solvente orgânico na solução eluente Proteína ricas em aminoácidos mais apolares: mais retidas Proteínas ricas em aminoácidos mais polares: menos retidas