EXERCÍCIOS BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL

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1 Departamento de Bioquímica Instituto de Química - USP EXERCÍCIOS BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL QBQ Professores Carlos T. Hotta Fabio Luis Forti Ohara Augusto Ricardo J. Giordano 1

2 1. Para obter um emprego de bioquímico, solicita-se que você assista a um vídeo que mostra um colega purificando a citrato sintase a partir de coração de boi. Em determinados passos do protocolo (descrito abaixo) o entrevistador para o vídeo e lhe coloca questões. Responda as questões formuladas (em itálico). a) Vinte quilos de coração bovino são retirados de um matadouro e transportados ao laboratório em gelo. O bioquímico começa a processar os corações e realiza todas as etapas numa câmara fria (~5 o C) ou sob gelo. O tecido cardíaco é picado, suspenso em uma solução de sacarose,2 M tamponada a ph 7,2 e homogeneizado com um homogeneizador de alta velocidade. Porque foi utilizado tecido cardíaco e em grande quantidade para purificar a citrato sintase? Qual o propósito de manter o tecido frio e suspendê-lo em sacarose,2 M a ph 7,2? O que ocorre com o tecido quando é homogenizado? b) O homogenato do tecido, que é denso e opaco, é submetido a uma série de etapas de centrifugação diferencial. O que se consegue com esse procedimento? c) A purificação continua com a fração que contém principalmente mitocôndrias intactas. Essas são então lisadas osmóticamente. O lisado que é menos denso que o homogenado, mais ainda opaco, consiste principalmente de membranas mitocôndriais e conteúdo mitocôndrial interno. Ao lisado, adiciona-se sulfato de amônio até uma concentração específica. A solução é centrifugada, o precipitado descartado e o sobrenadante recolhido. A este, que é mais claro que o lisado, adiciona-se mais sulfato de amônio. Nova centrifugação é realizada, mas desta vez, o precipitado é recolhido porque contém a proteína de interesse. Qual a razão para se adicionar o sal em duas etapas? d) O precipitado de sulfato de amônio é solubilizado e dialisado contra grandes volumes de uma solução tamponada a ph 7,2. Por que o sulfato de amônio não é incluído no tampão de diálise? Por que se utiliza uma solução tamponada em vez de água? e) A solução dialisada é aplicada em uma coluna de cromatografia por exclusão. A eluição das proteínas da coluna é acompanhada por medidas de absorção de luz das frações a 28 nm. A primeira fração protêica que sai da coluna é recolhida e todas as outras frações são descartadas. O que a coleta da primeira fração nos diz sobre a 2

3 proteína de interesse? Por que a absorção de luz a 28 nm é uma boa maneira de se monitorar a presença de proteínas nas frações eluídas? f) A fração coletada em e) é então aplicada numa coluna cromatográfica de troca catiônica. Após desprezar a solução inicial que deixa a coluna, o bioquímico adiciona uma solução de ph mais alto à coluna e colhe a fração protéica que é imediatamente eluída. Qual a razão para o bioquímico fazer isso? 2. O ácido dinitrosalicílico (DNS) pode ser usado para medir a quantidade de açucares redutores em amostras, pois a reação deste com o grupo aldeído livre presente no carbono 1 das aldoses, ou com o grupo cetônico presente em frutoses, libera um produto que absorve luz a 54 nm. Alunos de um curso de bioquímica experimental, usando uma solução 5 mm de glicose, montaram a seguinte curva padrão e obtiveram os seguintes resultados após ferver as amostras por 1 min. Glicose Água reagente DNS Massa de glicose Abs ( g) 54 nm 5 5, , , , , , , , , , ,2 O reagente da Glicose Oxidase (TGO) pode ser usado para medir especificamente a quantidade de glicose presente em uma amostra. A glicose oxidase, ao oxidar glicose, reduz um grupo NAD+ para NADH. Essa reação pode ser acoplada à oxidação de um grupo como a o-dianisidina, a qual ao ser oxidada passa a absorver luz a 42nm. Foi montada uma curva padrão com uma solução de glicose,5 mm e, após incubar a amostra por 1 hora a 37 C para ocorrer a reação foram obtidos os seguintes resultados 3

4 Glicose Água reagente TGO Massa de glicose Abs ( g) 42 nm 5 5, , , , , , , , , , , O reagente Fenol-Sulfúrico (FS) pode ser usado para medir a quantidade de açucares presentes em uma amostra, pois após a hidrólise pelo ácido sulfúrico e a reação do fenol com os grupos hidroxila é gerado um produto que absorve a 49 nm. Foi montada a curva padrão abaixo com uma solução de glicose 1 mm e após a reação foram obtidos os dados abaixo Glicose Água reagente FS Massa de glicose Abs ( g) 49 nm 4 4, , , , , , , , , ,514 4

5 Uma série de homogeneizados do caule de diferentes linhagens de cana de açúcar foi testada para saber qual das linhagens possui a maior quantidade de açucares solúveis, o que é de grande interesse para a indústria açucareira. Uma certa massa de tecido foi homogenizada em água e este material foi centrifugado por 1 min a 1. xg a 4 C. O sobrenadante foi diluído é usado para determinação de açucares com os métodos do ácido dinitrosalícilico (DNS), glicose oxidase (TGO) e fenol-sulfúrico (FS). Os resultados estão expostos na tabela abaixo. Linhagem Massa de tecido (g) Volume final do sobrenadante (ml) Diluição (x) Amostra () Abs 54nm (DNS) Abs 42 nm (TGO) Abs 49 nm (FS) ,1,3, ,5,1 1, ,3,2 1, ,2 -,9, ,1,1, ,,7 1, ,1 -,8 1, ,3 -,1 1, ,2,1 1, ,8,2 1,487 Qual das técnicas é a melhor para esse teste? Como você explicaria esses resultados? Calcule a concentração de açucares solúveis nos diferentes homogeneizados e a quantidade de açúcar que pode ser obtida por grama de tecido vegetal. Qual das plantas é a melhor para a produção de sacarose? 3. Uma indústria farmacêutica está interessada na produção de alfa-glicosidase de levedura para geração de glicose e frutose a partir de açúcar da cana (sacarose). Para tal obteve várias linhagens de levedura e necessita medir a atividade de alfa-glicosidase presente nas células. Quais das técnicas DNS, TGO ou FS você usaria para medir a atividade dessa enzima, usando sacarose como substrato 5

6 4. A indústria farmacêutica preparou lisados de levedura de diferentes linhagens. Em todas as amostras usou 1g de células e obtiveram 1 ml de lisado. Esses lisados foram utilizados para ensaios enzimáticos, empregando p-nitrofenil -glicosídeo (pnp glc) como substrato. Foram obtidos os resultados a seguir linhagem diluição l lisado diluído água pnp glc Abs min Abs 42 3 min Abs min Abs 42 6 min A 1x 1 1 2,5,1,15,2 B 5x ,8,16,24,32 C 8x ,25,5,75 1, D 7x 2 2,1,2,3,4 E 5x 2 2,1,2,3,4 F 2x 2 2,75,15,225,3 As mesmas amostras foram submetidas à determinação de proteínas com o reagente de Bradford (comassie blue G), obtendo-se os dados a seguir. Confeccionou-se também uma curva padrão usando albumina de ovo. Dados para amostras experimentais linhagem diluição l lisado diluído água Reagente Bradford (ml) Abs min A 2x 1 1,265 B 5x 2 8 1,32 C 1x 5 5 1,55 D 2x 8 2 1,15 E 5x 1 9 1,75 F 8x 1 1,415 6

7 Dados da curva padrão Albumina,2 g/l água Reagente de Bradford (ml) Massa de proteína Abs 595nm 1 1, , , , , , , , , ,72 1 1,8 Calcule a concentração de atividade enzimática no lisado de cada uma das linhagens de levedura. Calcule também a atividade obtida por grama de células. Calcule a concentração de proteína em cada um dos lisados e a atividade específica de cada um dos materiais. Se o próprio lisado for utilizado industrialmente como fonte de enzima, qual das linhagens é melhor para produzir essa enzima em larga escala? Se for necessário purificar a enzima, qual das linhagens é a melhor fonte? Justifique as respostas. 5. Um homogeneizado do epitélio do tubo digestivo de rato apresenta atividade da enzima alfa-glicosidase. Para as condições de preparação deste homogeneizado obtevese uma atividade enzimática de 8 mu/ml e uma atividade específica de 8 mu/mg. A fim de purificar esta alfa-glicosidase, 1,5 ml deste homogeneizado foram submetidos a uma cromatografia de troca iônica em uma coluna DEAE-celulose e obteve-se o seguinte perfil de atividade de alfa-glicosidase nos tubos coletados durante a cromatografia: 7

8 ,3 1 abs 42nm (linha contínua),2,1, [NaCl] (M) (linha tracejada) tubos Os tubos com maior atividade de alfa-glicosidase foram reunidos. Este material com volume de 1, ml foi denominado material DEAE. Em seguida, o material DEAE foi utilizado para determinação de atividade enzimática e concentração de proteína total. As condições do ensaio de atividade enzimática e os resultados obtidos estão descritos na tabela abaixo: Substrato (p-nitrofenil - Material DEAE Tempo de incubação a 3 C Abs 42nm glucosídeo 4 mm) (min) 5 microlitros 5 microlitros 5,1 5 microlitros 5 microlitros 1,19 5 microlitros 5 microlitros 15,32 5 microlitros 5 microlitros 2,4 Nas condições de ensaio de atividade de alfa-glicosidase descritas acima, a curva padrão utilizada para cálculo da atividade enzimática tem a equação Abs =.56 nmols. As condições utilizadas para determinação da concentração de proteína total estão descritas na tabela abaixo: Material DEAE Água Reagente de Bradford Abs 595 nm (ml) (ml) (comassie blue G),1 ml,99 ml 1 ml,52,4 ml,96 ml 1 ml,13,5 ml,95 ml 1 ml,15,1 ml,9 ml 1 ml,35 8

9 A curva padrão do reagente de Bradford preparada nas mesmas condições de volume que a tabela acima está apresentada a seguir.,2 y =,1x +,5 R 2 = 1 abs 595nm, microgramas de proteína Utilizando estas informações e resultados determine: 1 A atividade enzimática (mu/ml) do material DEAE 2 A concentração de proteína total (mg/ml) do material DEAE 3 A atividade específica do material DEAE 4 A recuperação de atividade enzimática após a cromatografia de troca iônica 5 O enriquecimento da atividade enzimática após a cromatografia de troca iônica Obs: 1 mu (miliunidade) de atividade enzimática corresponde a quantidade de enzima que catalisa uma reação química com a velocidade de formação de 1 nmol de produto/minuto. 6. As figuras a seguir apresentam o perfil de eluição da atividade de alfa-glicosidase em uma cromatografia de troca aniônica em coluna DEAE-celulose. Cada uma das cromatografias foi realizada utilizando um tampão com ph diferente (9, 8, 6,). Com base nos resultados responda qual a provável faixa de valores do pi (ponto isoelétrico) desta alfa-glicosidase. 9

10 .3 1 abs 42nm (linha contínua) [NaCl] (M) (linha tracejada) ph tubos tampão ph 9,3 1 abs 42nm (linha contínua),2,1,8,6,4,2 [NaCl] (M) (linha tracejada) ph 8, tubos tampão ph 8,3 1 abs 42nm (linha contínua),2,1,8,6,4,2 [NaCl] (M) (linha tracejada) ph 6, tubos tampão ph 6 7. Você conseguiu purificar uma celulase através da marcha de purificação a seguir. 1º passo: cromatografia de troca aniônica em ph 1. 2º passo: cromatografia de filtração em gel em ph 6,. Após cada passo os tubos que continham a atividade de celulase foram reunidos. Para este material foi calculada a atividade enzimática total de celulase e também a quantidade de proteína. A tabela abaixo resume estes resultados. Passo Atividade de celulase aplicada (U) Atividade de celulase recuperada (U) Proteína total aplicada (mg) Troca iônica Filtração em gel Proteína total recuperada (mg) 1

11 Após cada cromatografia os tubos que continham atividade de celulase também foram reunidos e analisados por SDS-PAGE. Figura 1 SDS-PAGE de materiais recolhidos ao longo da marcha de purificação. M T F P kda Início Fim M meio de cultura; T material recuperado após cromatografia de troca aniônica. F material recuperado após cromatografia de filtração em gel; P padrões de peso molecular. Para a coluna de filtração em gel usada na marcha de purificação foi previamente preparada uma curva de calibração utilizando proteínas de diferentes pesos moleculares. Os dados obtidos estão descritos na tabela abaixo juntamente com o resultado para cromatografia da celulase. Tabela 2 Volumes de eluição na cromatografia de filtração em gel em uma coluna cujo, volume total é 25ml. Material Volume de eluição (ml) Proteína padrão de 2.. daltons 7.53 Proteína padrão de 66. daltons 9.38 Proteína padrão de 45. daltons 1.46 Proteína padrão de 12.4 daltons 13.7 Proteína padrão de 6.5 daltons ATIVIDADE CELULÁSICA 9.58 a) Calcule a recuperação da atividade enzimática após cada um dos passos da purificação da celulase. b) Calcule a atividade específica da celulase após cada um dos passos da marcha de purificação. c) Qual dos passos é melhor na purificação desta enzima? Por quê? 11

12 d) Calcule a massa molecular da enzima determinada por SDS-PAGE e por filtração em gel. Compare os valores e formule hipóteses para explicar os resultados. 8. O gráfico abaixo representa a atividade enzimática de alfa-glicosidase eluída em uma cromatografia de troca iônica em coluna DEAE-celulose. Sabendo que o ponto isoelétrico (pi) desta enzima é 7, e que esta cromatografia foi feita em tampão ph 8, construa um esboço do gráfico esperado para cromatografias realizadas em ph 9, e ph 4,. Estes esboços devem indicar o ponto de eluição da atividade enzimática em relação ao gradiente de NaCl. abs 42nm (linha contínua),3,2,1 1,8,6,4, tubos tampão ph 8 [NaCl] (M) (linha tracejada) 9. Duas proteínas A e B apresentam uma solubilidade em função do ph dada pelo gráfico abaixo. Quando uma mistura dessas proteínas em tampão de ph 6, é aplicada em uma coluna de troca aniônica, uma delas é eluída normamente, enquanto a outra só é eluída após adição de tampão com quantidades crescentes de NaCl. Baseado nos dados acima, diga qual proteína é eluída após adição de NaCl. Justifique sua resposta. 1. Um bioquímico recebeu uma amostra para análise. Nela, havia diversas proteínas que precisavam ser separadas umas das outras. Numa primeira etapa, o bioquímico utilizou uma coluna de gel filtração recomendada para proteínas de alto peso molecular (>6 kda) e obteve o seguinte perfil de eluição: 12

13 Figura - Perfil da cromatografia de gel filtração em Superdex-2. As proteínas separadas foram coletadas nos tubos 1, 2, 3 e 4, conforme indicado na figura. Os volumes aproximados de eluição para cada tubo foram: Tubo 1 = 1 ml Tubo 2 = 11 ml Tubo 3 = 13 ml Tubo 4 = entre 14,5 e 15 ml Volumes aproximados (+/-,5 ml) Usando essa mesma coluna de gel filtração, nas mesmas condições da corrida anterior, o bioquímico analisou os padrões de peso molecular, obtendo os seguintes resultados: Padrão Vol. Eluição (ml) Proteína padrão de 2. kda 7.53 Proteína padrão de 25 kda 9.38 Proteína padrão de 17 kda 1.46 Proteína padrão de 65 kda 13.7 Proteína padrão de 24 kda Volume total da coluna = 25 ml Os tubos marcados de 1 a 4 foram então analisados por SDS-PAGE em condições redutoras e não redutoras, sendo obtido o seguinte perfil: Figura - Eletroforese de SDS-PAGE em condições redutoras (c/ -mercaptoetanol) e não redutoras das proteínas contidas nos tubos 1, 2, 3 e 4. No último poço, encontram-se os padrões de pesos moleculares. 13

14 Após analisar os dados, o bioquímico então decidiu submeter a amostra do tubo 4 a uma cromatografia de troca de ânions (-) em ph 7, seguida de eletroforese SDS-PAGE das frações obtidas. Os resultados da cromatografia e da eletroforese estão na figura abaixo: Figura - Cromatografia de troca de ânions das proteínas no tubo 4 e eletroforese das proteínas presentes nos tubos 4A e 4B. O bioquímico deu-se então por satisfeito e escreveu o seu relatório final. a) Quantas proteínas estavam presentes na amostra? b) Qual o peso molecular de cada uma delas? Quais continham mais de uma subunidade e qual o peso molecular de cada cadeia proteica? c) Qual o pi aproximado de cada proteína do tubo 4 (maior, menor ou próximo de 7)? 11. Para uma alfa-glicosidase foram determinadas as velocidades de hidrólise de diferentes concentrações de substrato (NpaGlc) na presença de diferentes concentrações de um inibidor. Estes dados estão apresentados na tabela abaixo. Baseando-se nesta tabela determine o Vmax e o Km para a hidrólise do substrato e o Ki para este inibidor. [S] (mm) V (nmol/min) [I] (mm)

15 Tecido embrionário de fígado contém uma enzima que catalisa a reação S P. Tecido de fígado adulto também apresenta a atividade S P. Alguns dados cinéticos obtidos com extratos dos dois tecidos são apresentados abaixo. Que conclusões você pode tirar com relação a identidade das duas enzimas? Velocidade Inicial Observada [S] ( -moles x mg de proteína -1 x min -1 ) [M] Extrato de Fígado Adulto (E 1 ) Extrato de Fígado Embrionário (E 2 ) 1,67 x 1-5 1,5 5, 2,5 x 1-5 1,54 6,66 3,33 x 1-5 1,98 8, 5, x 1-5 2,86 1, 7, x 1-5 3,78 11,67 1, x 1-4 5, 13,33 1,5 x 1-4 6,67 15, 1,67 x 1-4 7,15 15,4 2, x 1-4 8, 16, 3, x 1-4 1, 17,1 13. Durante danos consideráveis do fígado, uma enzima (E 1 do Probl. 1) é liberada na corrente sanguínea. Após exercícios intensos, uma enzima de músculo, E 3, que catalisa a mesma reação, é liberado na corrente sanguínea. E 1 E 3 podem ser diferenciadas facilmente porque apresentam diferentes valores de K m (A K m da enzima de músculo é 2 x 1-5 M.) Uma determinação com uma amostra de sangue de um paciente apresentou os resultados dados na tabela abaixo. O paciente sofre de uma doença do fígado, ou simplesmente tem se exercitado violentamente? (O paciente chegou inconsciente no hospital, de modo que você não pode fazer a ele nenhuma pergunta). [S] (M) v (moles x ml de soro -1 x min -1 ) 5 x x x ,5 x x x x

16 14. Os dados cinéticos abaixo foram obtidos para diferentes inibidores de uma enzima. Determine a natureza de cada inibidor e calcule o Ki. Velocidade Inicial (nmoles/min) [S] (mm) (Controle) +I a 6 M +X a 3 M +Y a 4mM +Z a,2mm,2 16,67 6,25 5,56 1, 8,89,25 2, 7,69 6,67 11,11 1,81,333 24,98 1, 8,33 12,5 13,78,5 33,33 14,29 11,11 14,29 19,5 1, 5, 25, 16,67 16,67 3,77 2, 66,67 4, 22,22 18,18 44,44 2,5 71,4 45,45 23,81 18,52 48,78 3,33 76,92 52,63 25,64 18,87 54,4 4, 8, 57,14 26,67 19, 57,14 5, 83,33 62,5 27,77 19,23 6,6 15. Um nonapeptideo foi submetido a uma série de experimentos a fim de determinar sua estrutura primária. Inicialmente o peptídeo foi incubado com dinitrofluorobenzeno (DNF) e a seguir submetido a uma hidrólise ácida (HCl 6N 11ºC 3h). Os produtos deste procedimento foram analisados em cromatografia de camada delgada revelando o resultado abaixo: Peptídeo Phe Ala Asp Posteriormente o nonapeptídeo foi hidrolisado na presença de quimotripsina. Os produtos desta reação foram separados e submetidos à degradação de Edman, obtendo-se o resultado abaixo: Produto 1: Ala Arg Pro Glu Produto 2: Ala Gly Phe Produto 3: Ala Phe 16

17 Por fim, o oligopeptideo foi hidrolisado na presença de tripsina, os produtos foram separados e submetidos à degradação de Edman. O resultado obtido foi: Produto 1: Ala Phe Ala Gly Phe Ala Arg Produto 2: Pro Glu Qual a estrutura primária deste oligopeptideo? Dados: Quimotripsina catalisa a hidrólise de ligações peptídicas após Phe. Tripsina catalisa a hidrólise de ligações peptídicas após Arg. 16. Uma mistura dos seguintes peptídeos: lisil-lisina e leucil-leucil-leucina foi submetida a uma corrida cromatográfica em papel no sistema de solvente composto por: butanol: ácido acético; água (4:1:1). Qual o peptídeo que apresenta maior Rf e por que? 17. Um estudante executou o seguinte protocolo: 1. Pesar 1 mg de um dipeptídeo, 1mg de fenilalanina, 1 mg de ácido aspártico e 1 mg de glicina 2. Colocá-los em tubos separados com tampa de rosca e seguir os passos abaixo para cada um destes tubos. 3. Adicionar ao tubo,75 ml de bicarbonato de sódio. 4. Adicionar ao tubo,5 ml de DNF (dinitrofluorobenzeno) preparado em etanol. 5. Fechar o tubo. 6. Transferir o tubo para um banho a 3oC. 7. Incubar o tubo por 3h. 8. Retirar o tubo após esse período. 9. Resfriar o tubo. 1. Acidificar o meio com duas gotas de ácido clorídrico 6M. 11. Transferir o tubo para um concentrador a vácuo 12. Incubar o tubo por 15 min para secar o etanol. 13. Retirar o tubo após esse período. 14. Adicionar ao tubo 1 ml de ácido clorídrico 6M. 15. Transferir o tubo para um bloco térmico (115 C). 16. Incubar o tubo por 3h. 17. Retirar o tubo após esse período. 18. Resfriar o tubo em temperatura ambiente. 19. Retirar 2 μl e transferir para um tubo de ensaio. 2. Transferir o tubo de ensaio para um concentrador a vácuo. 21. Aguardar a amostra secar completamente. 22. Retirar o tubo após esse período. 23. Resfriar o tubo. 24. Adicionar 2 μl de etanol ao tubo. Em seguida 2 μl do material correspondente ao passo 24 para cada uma das amostras iniciais (dipeptídeo, fenilalanina, glicina e ácido aspártico) foram submetidos à separação em cromatografia de camada delgada utilizando a fase móvel Clorofórmio- Metanol-Ácido acético Foi obtido o resultado abaixo. 17

18 Responda: a) O protocolo acima foi realizado com o objetivo de obter qual informação a respeito do dipeptídeo? Considerando que estudante deixou de anotar a identificação das amostras 2, 3 e 4 e sabe apenas que a amostra 1 corresponde ao dipeptídeo. b) identifique o material (tipo de aminoácido) presente nas amostras 2, 3 e 4. Justifique sua resposta. c) identifique as manchas indicadas com as setas no material 1. Justifique sua resposta. d) Caso os passos 14 a 22 fossem omitidos do protocolo acima, qual das bandas (manchas) do material 1 teria uma migração diferente? Justifique a resposta. e) Caso os aminoácidos fenilanalina, ácido aspártico e glicina fossem dissolvidos em etanol e diretamente submetidos à separação em cromatografia de camada delgada em placa de sílica sem passarem pelas etapas do protocolo acima, qual das fases móveis sugeridas abaixo seria a mais indicada. Justifique sua resposta. Clorofórmio-Metanol- Ácido acético (95-4-1) Clorofórmio-Metanol-Acido acético (6-3-1) Clorofórmio- Metanol (97-3) 18