Aplicações tecnológicas de Celulases no aproveitamento da biomassa
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- Elza Alencar Valverde
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1 IV SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE TECNOLOGIAS E TRATAMENTO DE RESÍDUOS - ECOS DE VENEZA 09 Novembro 2011 Casa da Ciência UFRJ - RJ Aplicações tecnológicas de Celulases no aproveitamento da biomassa Luzia T.A.S.Semêdo, DSc.
2 Razões ambientais açúcares
3 Evolução da produção da cana-de-açúcar etanol e cana-de açúcar Projeto Pró alcool Inicio em 1975 UNICA e MAPA, 2011
4 Produção mundial de bioetanol combustível em 2008 Elaborado com base em RFA (2010)
5 Uso da Terra no Brasil Área referente ao ano de 2009 ICONE, ESALQ e IBGE.
6 Recursos nacionais 44% da matriz energética do Brasil é renovável e 13,5% é derivada da cana-de-açúcar; O Brasil gera aproximadamente 600 milhões de toneladas de resíduos agroindustriais e florestais por ano.
7 Visão Geral do Processo Mecânicos Térmicos Ácidos Álcalis Oxidação Pentoses Levedura s Coleta e redução de tamanho Prétratamento Hidrólise enzimática Xarope rico em glicose Fermentação Biomassa Produção de enzimas Lignina Destilação Micro-organismos Caldeiras ETANOL Paredes, 2011
8 Biomassa lignocelulósica
9 Estrutura da Biomassa Hemicelulose Pré-tratamento Hemicelulose Lignina Celulose Lignina Celulose Parveen Kumar et al
10 Estrutura da celulose homopolissacarídeo de β-1,4 glicose (forma linear) β-1,4 Celobiose Ghosh & Ghosh, 1993
11 Níveis de organização da celulose cristalina
12 Hidrólise Enzimática da Celulose Enzimas do complexo celulásico são inibidas por celobiose e glicose
13 Fermentação alcóolica
14 Métodos de trabalho com celulases Fontes de nutrientes: vantagem dos resíduos agroindustriais Bagaço de cana de açúcar Dresh cervejeiro Farelo de trigo milhocina
15 Discos de papel enterrados
16 Meio seletivo de celulose azure
17 suspensão de esporos ou pré-inóculo Fermentações submersas (exemplo) Incubação: 200 rpm, 30 C 300 ml de meio 1mL da suspensao de esporos incubação: 4 dias, 30 C, 200 rpm 100mL de meio Retirada de alíquotas diárias para realização de dosagens da concentração de açúcares redutores, celulases e ph
18 Medida da atividade enzimática 1. Atividade endoglucanase / CMCase Mistura reacional 3,0 ml CMC 4%, tampão citrato de sódio, ph 4,8 + 3,0 ml sobrenadante 50 C, até 10 min Retirada de alíquotas a cada 2 minutos 0,5ml DNS Dosagem da concentração de açúcares redutores
19 Medida da atividade enzimática 2. Atividade exoglucanase / FPase Mistura reacional 1,0 ml tampão citrato de sódio ph 4,8, 50mM + 0,5 ml sobrenadante 50 C, 60 minutos, sob agitação + 1 tira de papel de 0,5ml DNS filtro 1,0 X 6,0 cm (~50mg) Dosagem da concentração de açúcares redutores
20 Medida da atividade enzimática 3. Atividade β-glicosidase 1,0 ml solução de celobiose 15mM + 1,0 ml sobrenadante 50 C, 30 minutos, sob agitação Kit de glicose oxidase Dosagem da concentração de glicose P-nitro-fenil-glicosídeo
21 Métodos analíticos Dosagem da concentração de proteína total solúvel (Método de Lowry et al. (1951) ou Bradford (1976) Dosagem da concentração de açúcares redutores (Miller, 1959) DNS redução de 3,5-dinitrosalicitato (de cor amarelo forte) a 3-amino-5-nitro-salicilato (de cor laranja-marrom) f Leitura a 540nm Dosagem da concentração de glicose Glicose oxidase Glicose + ½ O 2 + H 2 O Ácido Glucónico + H 2 O 2 peroxidase 2 H 2 O Aminoantotipirina + Fenol Quinonaimina + 4 H 2 O Leitura a 500nm
22 Outras análises Determinação da atividade específica (UI/ mg de proteína) Gel de atividade enzimática (zimogramas) Gel de poliacrilamida com ou sem SDS (0,2% CMC) Incubação à 50 C, ph 4,8 durante 1h 130V, 1h Revelação com Vermelho do Congo
23 Caracterização das celulases Determinação do efeito da temperatura Podem ser testadas temperaturas na faixa de 30 C a 100 C. Determinação do efeito do ph Podem ser testados valores de ph na faixa de 3,0 a 10,0. Termoestabilidade da enzima A enzima poderá ser incubada no ph ótimo, e nas temperaturas de 40 C, 50 ºC, 60 ºC, etc, durante um período de tempo variado, de horas até dias. Estabilidade da enzima ao ph A enzima podrá ser incubada na temperatura ótima, e nos valores de ph de 3,0 a 10,0, durante um período de tempo variado, de horas até dias. Estabilidade da enzima a íons metálicos, e outros compostos (EDTA, etc)
24
25 Obrigada! NREL
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