Avaliação do Uso de Diferentes Indutores na Produção de Celulases com Aspergillus sp. 554 por Fermentação em Estado Sólido

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1 Avaliação do Uso de Diferentes Indutores na Produção de Celulases com Aspergillus sp. 554 por Fermentação em Estado Sólido Thiago B. da Silva 1,*, Dahiane G. C. Gebert 1, Carina Langaro 1, Fabiano B. Sheufele 1, Isabela F. Marra 1, Mônica L. Fiorese 1, Salah D. M. Hasan 1 (1) NBQ Núcleo de Biotecnologia e Desenvolvimento de Processos Químicos. Universidade Estadual do Oeste do Paraná UNIOESTE, Campus Toledo-PR. eng_thiago@hotmail.com Resumo: A geração de resíduos lignocelulósicos e sua destinação constitui uma problemática das agroindústrias, em especial a altíssima quantidade de bagaço de cana gerada pelas indústrias sucroalcooleiras. A presença de celulose e outros polissacaríedos nestes resíduos, juntamente com a necessidade de novas fontes de energia renováveis, tornam o bagaço de cana-de-açúcar uma alternativa viável para a bioconversão via enzimas hidrolíticas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de enzimas celulases do Aspergillus sp. 554 através de fermentação em estado sólido (FES) visando a bioconversão do bagaço de cana-de-açúcar e avaliar os efeitos dos indutores carboximetilcelulos (CMC), lactose P.A. e permeado de soro de leite. A maior atividade enzimática obtida foi de 0,528 U.g -1 no tempo de 72 h utilizando o permeado de soro de leite. Palavras Chave: Fungos Lignocelulolíticos, Hidrólise Enzimática, Fermentação em Estado Sólido. INTRODUÇÃO A geração mundial de resíduos lignocelulósicos resulta em poluição do meio ambiente e em perdas de materiais valiosos que podem ser bioconvertidos em vários produtos de valor agregado (HOWARD et al., 2003). A crescente demanda mundial por energia gerada através de fontes renováveis e ecologicamente corretas, aliada a presença de resíduos com altos teores de celulose e outros polissacarídeos em sua constituição, viabilizam a conversão da biomassa lignocelulósica, por hidrólise enzimática, em açúcares fermentáveis. O principal componente de materiais lignocelulósicos é a celulose, seguido pela hemicelulose e lignina. A celulose é um polímero linear composto de subunidades de D-glicose ligadas por ligações β-1,4 glicosídicas formando o dímero celobiose. Estes formam longas cadeias unidas por ligações de hidrogênio e forças de Van der Waals (SÁNCHEZ, 2009). Uma das grandes fontes de materiais lignocelulósicos é a cana-de-açúcar, planta de suma importância para a economia brasileira, tornando-se grande geradora de 85 empregos e de energia via industrialização desta em açúcar e álcool (MANZANO et al., 2000). As vantagens do uso do bagaço como substrato para bioconversão são o alto conteúdo de carboidratos (celulose 50% e hemicelulose 25%), obtenção no local de processamento da cana, baixo custo e a geração constante (REZENDE et al., 2002). Desse modo, o bagaço apresenta grande potencial para um processo de produção de etanol mediante um processo de hidrólise prévia. Muitos micro-organismos são capazes de degradar e utilizar a celulose e hemicelulose como fontes de carbono e energia (SÁNCHEZ, 2009). As reações catalisadas por enzimas oxidativas tem um papel significativo na completa degradação da biomassa lignocelulolítica (SCHEUFELE, 2012). O gênero Aspergillus é considerado como um fungo ascomiceto degradante primário da celulose e lignina, além de ocorrer como espécie promotora de grande patogenicidade em plantas e animais. Este grupo de fungos filamentosos com um grande número de espécies possui características que os fazem micro-organismos ideais para aplicações

2 industriais, como boa capacidade de fermentação e altos níveis de secreção de enzimas (AGUIAR, 2010). A conversão inclui dois processos: hidrólise da celulose em materiais lignocelulósicos para produção de açúcares redutores e a fermentação do açúcar em etanol. Atualmente, sabe-se que o complexo celulásico secretado por fungos filamentosos é formado por três componentes enzimáticos majoritários, as endoglucanases, as celobiohidrolases (exoglucanases) e as β- glucosidases, que não são consideradas como celulases legítimas (MARTINS, 2005). A fermentação no estado sólido (FES) pode ser definida como o crescimento de micro-organismos em materiais sólidos na ausência de água livre, no entanto, o substrato deve conter umidade suficiente, existente na forma adsorvida na matriz sólida (PANDEY & RADHAKRISHNAN, 1992). As celulases, assim como as demais enzimas extracelulares de hidrólise, são induzidas quando há a necessidade de serem secretadas pelos micro-organismos para que estes cresçam em celulose (KUBICEK et al., 1993). A resposta das células fúngicas aos diferentes indutores varia dependendo da concentração e tipo do indutor, ou pela presença de glicose ou outros açúcares no meio de crescimento. Os indutores da síntese de celulolítica têm duas funções, ou seja, podem servir como fonte de carbono para o crescimento celular, ou mesmo como indutores da síntese enzimática (GONG & TSAO, 1975). Apesar da principal fonte de carbono microbiano na fermentação em estado sólido ser representada pelo substrato sólido, o efeito indutor de compostos de menores massas moleculares como a carboximetilcelulose e dissacarídeos varia com a concentração e o tipo de indutor, o que requer o estudo das exigências nutricionais do micro-organismo para 86 estimular uma efetiva biossíntese enzimática e atingir expressivas produtividades de celulases (RODRÍGUEZ-ZÚÑIGA et al., 2011). Neste trabalho estudou-se o efeito do dissacarídeo lactose P.A. e permeado de soro de leite (que contém 15% de lactose), além da carboximetilcelulose (CMC), na secreção de celulases pelo fungo filamentoso Aspergillus sp 554 durante o processo de fermentação em estado sólido. MATERIAIS E MÉTODOS Micro-organismo e substrato Foi utilizado neste trabalho o fungo Aspergillus sp. 554 cedido pela Fundação Oswaldo Cruz FIOCRUZ através da Coleção de Fungos da Amazônia - CFAM. O fungo foi reativado em meio Potato Dextrose Agar (PDA) em estufa microbiológica (Quimis) a 30 C durante 7 dias. O bagaço de cana foi obtido junto a Usina Santa Terezinha Ltda. - USAÇÚCAR da unidade de Ivaté-PR. Fez-se o prétratamento alcalino oxidativo o qual foi considerado o melhor para a realização dos ensaios fermentativos através da metodologia adaptada por AGUIAR (2010). O pré-tratamento alcalino oxidativo consistiu de duas etapas: retirada do conteúdo solúvel e tratamento alcalino oxidativo. Inicialmente os resíduos lignocelulósicos, neste caso o bagaço de cana, foram introduzidos em água destilada por 6 h. Após este período é foi realizada a lavagem em água corrente e os resíduos secos em estufa na temperatura de 50 ºC. Em seguida, os resíduos lavados e secos foram pesados e inseridos em um erlenmeyer de 2 L. O peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ) 1% foi adicionado na proporção de 50 ml da solução para cada grama de resíduo. Ajustou-se o ph com hidróxido de sódio P.A. até o valor de 11,5. A suspensão foi agitada por 16h a temperatura ambiente em rotação de 200 rpm. Ao final da agitação, o conteúdo

3 insolúvel foi filtrado e lavado repetidamente e seco em estufa a 50 ºC por 2 dias. Fermentação em estado sólido Os ensaios fermentativos foram realizados a 30 C em estufa bacteriológica (QUIMIS). Ao todo foram utilizados 4 ensaios fermentativos para cada concentração de indutor utilizando 2 g de substrato. A concentração da solução de inoculo utilizado foi de 1,76x10 8 esporos ml -1, sendo introduzido um volume de 0,12 ml no ensaio fermentativo juntamente com a solução nutriente e o substrato, atingindo-se assim a relação sólido-líquido 1:9 e concentração final de esporos no meio fermentativo de esporos g -1. Os indutores utilizados foram adicionados na solução nutriente (Tabela 1), atingindo as concentrações de (g L -1 ): 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 e 8,3 para a carboximetilcelulose (CMC), 0,25; 0,5; 1,0; 2,0 e 3,0 para a lactose P.A e 1,0; 2,0; 3,0 e 8,3 para o permeado de soro de leite, que contém 15% de lactose na sua composição. Tabela 1. Composição da solução nutriente de Mandels-Weber utilizada na FES Nutriente Quantidade (g L -1 ) KH 2 PO 4 2,00 (NH 4 ) 2 SO 4 1,40 MgSO 4.7H 2 O 0,30 CaCl 2.2H 2 O 0,40 FeSO 4.7H 2 O 5,00 MnSO 4.H 2 O 1,56 ZnSO 4.7H 2 O 1,40 CoCl 2.6H 2 O 3,70 Peptona de carne 1,00 Após o período de 120 h, quando todos os ensaios foram retirados da estufa, realizou-se a extração das enzimas. Adicionou-se ao fermentado sólido uma solução-tampão fosfato de sódio 50 mm ph 7,0 na proporção 1:17 (g de sólido/ml de solução-tampão). Os frascos fermentados contendo o sólido e a solução-tampão são inseridos em incubadora com agitação orbital (SOLAB SL222/CFR) por 2h na temperatura de 35 C e agitação de 125 rpm. O sólido foi 87 removido por processo de filtração à vácuo com papel filtro e os extratos armazenados em frascos plásticos identificados. A atividade enzimática total de celulase (FPAse) foi determinada conforme o método do papel filtro (GHOSE, 1987). Os açúcares redutores foram medidos pelo método proposto por MILLER (1959). A FPAse foi expressa em U ml -1 ou U mg -1 de substrato. Uma unidade (U) de atividade enzimática (AE) libera 1 μmol de açúcar redutor por mililitro de caldo por minuto. Para os extratos, utilizou-se a mesma metodologia e obtiveram-se os valores de concentração de açúcar redutor dos extratos. Em seguida, determinou-se a atividade enzimática pela equação 01. V T AE (U ml -1 ) = AR. (01) 0,18.V C.T H Onde: AE: Atividade enzimática (U.mL -1 ) AR: Concentração de açúcar redutor produzido na etapa de hidrólise (g.l -1 ) V T : Volume total utilizado na hidrólise (tampão + extrato enzimático em ml), sendo 3,6 ml V C : Volume do caldo utilizado na hidrólise (ml), com valor de 0,2 ml T H : Tempo de hidrólise (min), sendo de 60 min 0,18: Equivalente mássico de 1 μmol de glicose (mg) RESULTADOS E DISCUSSÃO A atividade enzimática em função do tempo da FES utilizando CMC como indutor do tempo está representada na Figura 1.

4 AE (U/g) AE (U/g) AE (U/g) III Encontro Paranaense de Engenharia e Ciência 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 C = 0,5 g/l C = 8,3 g/l Figura 1. Atividade enzimática (AE) versus tempo da FES do Aspergillus sp. 554, indutor: CMC Pela Figura 1 observa-se que a carboximetilcelulose aparentemente apresentou efeitos de inibição no crescimento celular do Aspergillus sp. 554, onde a menor concentração (0,5 g L -1 ) utilizada resultou em um pico de atividade enzimática, com valor 0,277 U.g -1 em 48 h. De acordo com RODRÍGUEZ-ZÚÑIGA et al. (2011), pelo perfil da cinética de produção enzimática por A. niger na fermentação em estado sólido de farelo de trigo e bagaço de cana-de-açúcar com a adição de CMC 5 g L -1, a produção máxima de celulase total (0,4 U g -1 ) e endoglucanase (21,0 U g -1 ) foi observada após 72 h. Os resultados de atividade enzimática em função do tempo da FES utilizando lactose como indutor do tempo estão representados na Figura 2. 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 C = 0,25 g/l C = 0,5 g/l Na Figura 2 observa-se que com a utilização da lactose como indutor ocorreram as maiores produções enzimáticas no período de 24 h. As concentrações de 0,25 g L -1 e 3,0 g L -1 e não induziram a produção enzimática. SEHNEM et al. (2003) observaram que quando a lactose foi utilizada ocorreram os menores títulos enzimáticos para P. echinulatum, apresentando reduzida capacidade indutora para FPAases, demonstrando a diferença de resposta da indução da lactose para diferentes micro-organismos. A atividade enzimática em função do tempo da FES utilizando permeado de soro de leite como indutor do tempo está representado na Figura 3. Na figura 3 foi constatado que a indução com permeado de soro para produção de celulases atingiu os maiores níveis de AE dos 3 indutores testados, com atividade enzimática de 0,528 U g -1 no tempo de 72 h e concentração de 2,0 g L -1. A presença de outros mono e dissacarídeos e substâncias fontes de carbono no permeado, além de diversos nutrientes, podem ter contribuído para o efeito indutivo. 0,55 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 C = 8,3 g/l Figura 3. Atividade enzimática (AE) versus tempo da FES do Aspergillus sp. 554, indutor: permeado de soro de leite 0,1 0,0 Figura 2. Atividade enzimática (AE) versus tempo da FES do Aspergillus sp. 554, indutor: lactose 88 O aumento da AE com a utilização de permeado em relação à lactose foi de apenas 0,045 U g -1 em um intervalo de 48 h entre os picos de produção enzimática, para as concentrações de 2,0 g L -1 de lactose e

5 permeado. Deste modo, a lactose apresentase com bom potencial de indução em um curto período de tempo, porém o reaproveitamento do permeado de soro de leite, por ser um subproduto, é um fator decisivo para utilização em fermentações para produção de enzimas. CONCLUSÕES Foi possível observar que cada indutor apresentou um efeito diferenciado na produção enzimática. O fungo Aspergillus sp. 554 obtido do bioma amazônico alcançou os maiores teores enzimáticos com a utilização de permeado de soro como indutor, valores comparáveis aos apresentados na literatura, demonstrando um grande potencial de produção de celulases. Agradecimentos Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AGUIAR, Caroline M. Hidrólise enzimática de resíduos lignocelulósicos utilizando celulases produzidas pelo fungo Aspergillus niger. Dissertação (Mestrado). Toledo: Universidade Estadual do Oeste do Paraná, p. GHOSE, T. K. Measurement of cellulase activities. Pure and Applied Chemistry, v.59, p ,1987. GONG, C.S.; TSAO, G.T. Cellulase and biosynthesis regulation. Annual reports on fermentation process. New York: Academic, v.3, p HOWARD, R.L.; ABOTSI, E.; JANSEN VAN RENSBURG, E.L., HOWARD, S. Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production. Afr J Biotechnol 2003; 2: KUBICEK, C.P., MESSNER, R., GUBER, F., MACH, R.L., KUBICEK-PRANZ, E.M. The Trichoderma cellulase regulatory puzzle: from the interior life of a secretory fungus. Enzyme Microb. Technol. 15, 1993, p MANZANO, R. P.; FUKUSHIMA, R. S.; GOMES, J. D. F.; GARIPPO, G. Digestibilidade do bagaço de cana-deaçúcar tratado com reagentes químicos e pressão de vapor. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 29, n. 4, p , MARTINS, Leonardo F. Caracterização do complexo celulásico de Penicillium echinulatum. Dissertação (Mestrado). Curitiba: Universidade Federal do Paraná, p. MILLER, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry. v.31, n.3, p , PANDEY, A., RADHAKRISHNAN, S. Packed-bed column bioreactor for production of enzyme. Enzyme and Microbiology Technology, 14: , REZENDE, M. I.; BARBOSA, A. M.; VASCONCELOS, A. F. D.; ENDO, A. S. Xylanase production by Trichoderma harzianum Rifai by solid state fermentation on sugarcane bagasse. Brazilian J. Microbiol., v.33, p.67-72, RODRÍGUEZ ZÚÑIGA, U. F.; FARINAS, C. S.; NETO, V. B.; COURI, S.; CRESTANA, S. Produção de celulases por Aspergillus niger por fermentação em estado sólido. Pesq. agropec. bras., Brasília, v.46, n.8, p , ago SÁNCHEZ C. Lignocellulosic residues: Biodegradation and bioconversion by fungi. Biotechnology Advances, v.27, p , SCHEUFELE, F. B. Bioconversão de resíduos agroindustriais por micro-organismos do bioma amazônico produtores de enzimas lignocelulolíticas. 119 p. Dissertação (Mestrado), Universidade Estadual do Oeste do Paraná, SEHNEM, N. T.; BITTENCOURT, L. R.; CAMASSOLA, M.; DILLON, A. J. P. Produção de celulases por Penicillium echinulatum em meio de cultura contendo lactose. XIV Simpósio Nacional de Fermentações, 2003, Florianópolis. Proceedings SINAFERM,