EFEITO DE DIFERENTES FORMAS DE PREPARO DO INÓCULO E DE CONCENTRAÇÕES DOS NUTRIENTES NA PRODUÇÃO DE ETANOL POR Saccharomyces cerevisiae UFPEDA 1238

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1 EFEITO DE DIFERENTES FORMAS DE PREPARO DO INÓCULO E DE CONCENTRAÇÕES DOS NUTRIENTES NA PRODUÇÃO DE ETANOL POR Saccharomyces cerevisiae UFPEDA 1238 Lima, D. A. (1), Luna, R. L. N. (1), Rocha, J. M. T. S. (1), Silva, P. M. P. (1), Gouveia, E. R. (1) estergouveia@gmail.com (1) Departamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco - UFPE, Recife - PE, Brasil. RESUMO O objetivo deste trabalho foi comparar duas formas de preparação de inoculo para a fermentação utilizando Saccharomyces cerevisiae UFPEDA 1238, assim como avaliar o efeito da variação da concentração dos nutrientes do meio de cultura para a produção de etanol. Inicialmente foi preparado o inoculo de duas formas diferentes. Na fermentação 1 o inoculo foi adicionando diretamente aos meios de fermentação e na fermentação 2 houve uma filtração e ressuspensão microbiana para depois ser adicionada aos cinco meios de fermentação, todos com glicose como fonte de carbono e os seguintes sais: (NH 4 ) 2 SO 4, KH 2 PO 4 e MgSO 4.7H 2 O. Também foram adicionados extrato de levedura e peptona. As fermentações foram realizadas em erlenmeyer de 250 ml, sendo a fermentação 1 com um volume total de 250 ml à 34 C e sem agitação e a fermentação 2 com volume total de 50 ml à 34 C e 80 rpm. Foi utilizado como parâmetro a produtividade em etanol. A análise da variância mostrou que as produtividaes obtidas nos ensaios da fermentação 1 foram significativamente diferentes das produtividades dos ensaios da fermentação 2. Palavras-chaves: Meios de cultura, Fermentação, Produção de Etanol.

2 INTRODUÇÃO Saccharomyces cerevisiae é uma levedura aeróbia facultativa, onde os produtos finais do metabolismo do açúcar irão depender das condições ambientais em que o micro-organismo se encontra. Assim, em aerobiose, o açúcar é metabolizado em CO 2 e água, acompanhado de um grande crescimento em biomassa, enquanto que, em anaerobiose, a maior parte da fonte de carbono, é convertida em etanol e CO 2, processo denominado de fermentação alcoólica (Lima et al., 2001). Esta espécie de levedura tem sido utilizada industrialmente devido à alta tolerância ao etanol, quando comparada com outros microrganismos (LEGRAS et al., 2007). Nas fermentações, uma parte dos açúcares é utilizada para biossíntese de glicerol e ácido acético e para o crescimento celular, o que não permite que o rendimento em etanol seja 100 % (VARGA et al., 2004). Segundo Lima et al. (2001), S. cerevisiae utiliza o nitrogênio nas formas amoniacal, amídica ou amínica e o fósforo é absorvido na forma de H 2 PO 4 -. Por outro lado, o enxofre pode ser assimilado do sulfato. O meio de cultura para produção de etanol deve, portanto, conter todos os nutrientes necessários. O objetivo deste trabalho foi comparar duas formas de preparação de inoculo para a fermentação utilizando Saccharomyces cerevisiae UFPEDA Também foi possível avaliar o efeito da variação da 2

3 concentração dos nutrientes do meio de cultura para a produção de etanol. MATERIAL E MÉTODOS Micro-organismo A linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae UFPEDA 1238 foi utilizada na fermentação. A levedura foi cedida pela Coleção de Culturas do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco, Brasil. O meio de manutenção utilizado continha (em g/l): glicose (20), extrato de levedura (5), peptona (3) e ágar (15), em ph 7,0. Fermentações O inóculo foi preparado através da transferência da linhagem para erlenmeyer de 500 ml com 50 ml de meio de cultura contendo (em g/l): 20 glicose, 3 peptona, 4 extrato de levedura. Os frascos foram incubados em mesa agitadora à 30 C e 250 rpm durante 12 horas. Após esse período, o inóculo foi preparado de duas formas diferentes. Na fermentação 1, o inoculo foi transferido para um único frasco de 1 litro para ser distribuído de forma homogênea nos frascos contendo os meios de cultura para a produção de etanol. As fermentações foram realizadas em erlenmeyer de 250 ml, com um volume total de 250 ml à 34 C e 3

4 sem agitação. As amostras foram coletadas no início e após 36 horas. Na fermentação 2, a suspensão de células foi filtrada em membrana de diâmetro de poro igual a 0,45 µm. O filtrado foi descartado e a biomassa microbiana foi ressuspensa em 10 ml de água estéril, a qual foi transferida para um erlenmeyer de 250 ml contendo 50 ml de meio de fermentação. A fermentação foi realizada à 34 C e 80 rpm. As amostras foram coletadas no início e após 12 horas. Para ambos as fermentações foram utilizados cinco meios, todos com glicose como fonte de carbono e os seguintes sais: (NH 4 ) 2 SO 4, KH 2 PO 4 e MgSO 4.7H 2 O. Também foram adicionados extrato de levedura e peptona. A Tabela 1 apresenta a composição dos oito meios de cultura utilizados na fermentação. Tabela 1. Composição dos meios de cultura utilizados nas fermentações. Meio (g/l) (NH 4 ) 2 SO 4 KH 2 PO 4 MgSO 4.7H 2 O Extrato de levedura Peptona , ,25 0, , , Métodos analíticos Glicose, glicerol, ácido acético e etanol foram quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência utilizando um cromatógrafo da 4

5 Agilent (HP 1100, Germany), coluna Aminex HPX-87H + (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), 60 ºC, 0,6 ml/min de fase móvel (5 mm H 2 SO 4 ) e detecção por índice de refração (Gouveia et al., 2009). Análise estatística Foram realizadas análises de variância (ANOVA) utilizando o programa Microcal Origin 6.0. RESULTADOS E DISCUSSÃO A produtividade volumétrica é um parâmetro cinético onde é analisada a concentração de etanol (g/l) pelo tempo de fermentação. A Figura 1 mostra a produtividade volumétrica em 36 horas dos cinco ensaios durante a fermentação 1 à 34 ºC e sem agitação, onde houve uma variação de 0,075 a 0,104 g/l.h. Figura 1. Produtividade volumétrica em 36h da fermentação 1. 5

6 Foi realizada uma análise de variância com os cinco ensaios, sendo esses significativamente diferentes (F = 11,53 ; α = 0,05). Entretanto, a análise dos ensaios 1, 2, 3 e 4 não foram significativamente diferentes (F = 4,64; α = 0,05), caracterizando o 5 como o ensaio com menor produtividade em 36 horas de fermentação, apesar deste ensaio conter extrato de levedura e peptona. Provavelmente o meio mais rico proporcionou um maior crescimento. A produtividade entre os ensaios da fermentação 2 é apresentada na Figura 2, onde é possível verificar uma variação entre os cindo ensaio que vão de 0,144 a 0,166 g/l.h. Figura 2. Produtividade volumétrica em 12h da fermentação 2. Para a fermentação 2 também foi feita uma análise de variância entre os cinco ensaios, onde os resultados não foram significativamente diferentes (F = 4,06; α = 0,05). Por outro lado, uma análise de variância 6

7 foi feita entre os ensaios 1, 2, 3, 4 e 5 das duas fermentações, onde todos os resultados mostraram-se significativamente diferentes. Entretanto, a fermentação 2 apresentou-se como a melhor condição, dentre as testadas neste trabalho, para produção de etanol, visto que sua produtividade é superior às obtidas na fermentação 1 em todos os ensaios. CONCLUSÃO De acordo com os resultados obtidos neste trabalho conclui-se que o preparo do inóculo com a ressuspensão das células foi mais adequado, uma vez que a concentração inicial de biomassa foi provavelmente maior e isto contribuiu para uma maior produtividade, independente das condições do meio de cultura. REFERÊNCIAS LEGRAS, J. L., MERDINOGLU, D., CORNUET, J-M., KARST, F Bread, beer and wine: Saccharomyces cerevisiae diversity reflects human history. Molecular Ecology 16, LIMA, U.A.; BASSO, L.C.; AMORIM, H.V Biotecnologia Industrial. Vol. III. São Paulo, Edgard Blücher LTDA, Cap. 1 Produção de etanol, p. 12. VARGA, E., KLINKE, H. B., RÉCZEY, K., THOMSEN, A. B High solid simultaneous saccharification and fermentation of wet oxidized corn stover to ethanol. Biotechnology and Bioengineering 88 (5):

8 GOUVEIA, E.R.; NASCIMENTO, R.T.; SOUTO-MAIOR, A.M.; ROCHA, G.J.M Validation of methodology for the chemical characterization of sugar cane bagasse. Quim. Nova. 32 (6),