PROSPECÇÃO DE BACTÉRIAS E LEVEDURAS LIPOLÍTICAS DO ESTADO DO TOCANTINS PROMISSORAS EM APLICAÇÕES INDUSTRIAIS

Tamanho: px

Começar a partir da página:

Download "PROSPECÇÃO DE BACTÉRIAS E LEVEDURAS LIPOLÍTICAS DO ESTADO DO TOCANTINS PROMISSORAS EM APLICAÇÕES INDUSTRIAIS"

Otávio Vilaverde Dias
5 Há anos
Visualizações:

1 PROSPECÇÃO DE BACTÉRIAS E LEVEDURAS LIPOLÍTICAS DO ESTADO DO TOCANTINS PROMISSORAS EM APLICAÇÕES INDUSTRIAIS Maysa Lima Parente Fernandes¹; Ezequiel Marcelino da Silva². 1 Aluna do Curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia; Campus de Gurupi; maysaparente@hotmail.com PIBIC/CNPq. 2 Orientador do Curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia; Campus de Gurupi; ezequielsilva@mail.uft.edu.br. RESUMO Lipases utilizadas comercialmente são geralmente obtidas de micro-organismos que produzem uma diversidade de lipases extracelulares, o que confere métodos mais simplificados de isolamento e, dessa forma se tornam mais estáveis. A seleção dos micro-organismos foi realizada através do mapeamento de pontos estratégicos no Estado do Tocantins, os frutos oleaginosos foram obtidos de uma propriedade rural no município de Gurupi. Basicamente utilizamos caroços de Tamarindus indica L.(Tamarindo) e Mangifera indica L. (Manga) foi realizada a raspagem das sementes para a obtenção dos micro-organismos, posteriormente isolados e inoculados em meio de cultura adequada. No segundo isolamento as cepas foram escolhidas de acordo com a coloração rósea e amarelada que apresentaram, 16 cepas foram selecionadas: D4, B6, C6, B4, C2, A4, A2, A6, 2C, 2D, 4C, 6A, 2B, 2C, 4A, 4B, sendo que as linhagens C2 e A4 foram utilizadas como controle. Todas as cepas selecionadas apresentaram atividade lipolítica, foi observada a alta atividade da linhagem isolada M-2C (Manga) seguida da cepa I-B6 (pastilha degradadora de gordura). As bactérias e leveduras isoladas dos frutos oleaginosos possuem um grande potencial na produção de lipases. É necessário atenção aos frutos do cerrado Tocantinense, isso equivale aos micro-organismos que têm inúmeras utilidades na biotecnologia. Neste trabalho, destaque para as cepas isoladas da Manga, que obtiveram um alto teor de atividade enzimática, provando assim a possibilidade e o sucesso do emprego desses micro-organismos para a produção de enzimas. Palavras-chave: Lipases; bactérias lipolíticas; leveduras lipolíticas.

2 INTRODUÇÃO Os biocatalisadores utilizados na atualidade representam uma fração bastante pequena do que é possível estimar. Cerca de apenas 1% da diversidade microbiana existente é possível de ser cultivada utilizando metodologia padrão. O Brasil, entretanto, possui uma vantagem territorial que torna o processo de triagem por novas enzimas para aplicação em processos catalíticos extremamente atrativos, além de necessário para conhecermos pelo menos uma parte da nossa microbiota. O termo seleção é utilizado para técnicas que permitem o crescimento ou vantagem de sobrevivência aos organismos que apresentam a função enzimática de interesse (OLIVEIRA e MONTOVANI, 2009). Por outro lado, os procedimentos de triagem envolvem a aplicação de um sistema rápido, suficientemente sensível e específico, que permita a identificação das variantes positivas. Os ensaios no formato de microplacas de 96 poços são bastante interessantes. É claro que a metodologia de triagem precisa ser necessariamente planejada e adaptada para encontrar a atividade enzimática de interesse (OLIVEIRA e MONTOVANI, 2009). MATERIAIS E MÉTODOS A seleção dos micro-organismos foi realizada através do mapeamento de pontos estratégicos no Estado do Tocantins onde se encontram a produção agrícola de grãos e frutos oleaginosos, entre outros. 1. Coleta de Microrganismos Lipolíticos do Estado do Tocantins. Utilizamos caroços de Tamarindus indica L.(Tamarindo) e Mangifera indica L. (Manga) foi realizada a raspagem das sementes para a obtenção dos micro-organismos. Foram isoladas colônias de bactérias e leveduras de pastilha para degradação de gordura contendo micro-organismos vivos para a medição da atividade lipolítica. A coleta de micro-organismos foi realizada transferindo as amostras para frascos de 50 ml contendo tampão fosfato 50 mm, ph 7,0. 2. Isolamento de Bactérias e Leveduras

3 O isolamento das bactérias e leveduras for realizado em meio NYSM, o qual contém para 1 litro de solução: 8 g de caldo nutriente, 1 g de extrato de levedura, 1 g de fosfato monobásico de potássio (KH2PO4) e 10 ml de solução de sais minerais (microelementos). O ph foi ajustado para 7,0 com NaOH ou KOH, o meio de cultura foi então autoclavado a 1 atm por 15 min e o meio sólido foi obtido com adição de 20 g/l de ágar-ágar. Em placas de Petri contendo o meio NYSM sólido foram transferidos 50 μl das amostras coletada em campo e espalhadas com o auxílio de pérolas de vidro e incubadas a 30 C por 24h. 3. Seleção de Bactérias e Leveduras Lipolíticas A seleção de bactérias e leveduras lipolíticas foi realizada por dois métodos. O primeiro consiste na transferência de colônias isoladas com o auxílio de palito de madeira estéril para áreas quadriculadas por baixo da placa de Petri contendo meio NYSM enriquecido com Tween 80. O segundo foi a transferência das mesmas colônias isoladas em microplacas de 96 poços contendo meio líquido NYSM enriquecido com pnpp (Palmitato de p-nitrofenila). Tanto as placas de Petri, quanto as microplacas de 96 poços foram incubadas a 30 C por 24h. Após este período, as microplacas de 96 poços receberam uma solução de bicarbonato de sódio a 10%. Os poços que apresentavam coloração amarelada possuíam uma indicação de que o microrganismo produz lipase, devido à liberação de p-nitrofenol durante a hidrólise de p-npp (ZAIA, 1998). 4. Cultivo de bactérias e leveduras As bactérias e leveduras selecionadas foram cultivadas em Erlermeyers de 250 ml contendo 100 ml de meio de cultura NYSM enriquecido com glicose a 2% e óleo de oliva a 2%. As culturas foram incubadas a 30 C sob agitação de 150 rpm por no mínimo 24h. As células foram centrifugadas a 4000 rpm por 10 min. O sedimento foi recuperado em solução de glicerol a 50% e armazenado a -80 C. O sobrenadante foi submetido ao ensaio de atividade enzimática (ZAIA, 1998). 5. Ensaios Enzimáticos

4 6. Palmitato de p-nitrofenila A determinação da atividade de lipase também foi realizada utilizando p-npp (Sigma St. Louis, USA) como substrato. A concentração p-nitrofenol liberado após ação da lipase foi determinada pela leitura da absorbância a 410 ηm. Os valores de absorbância obtidos foram transformados em μmoles de p-nitrofenol liberados em comparação à curva de calibração de p-nitrofenol. O método consiste em acompanhar a reação de 800 μl de p-npp (4mM) com 200 μl de extrato enzimático a 50 C por 30 min. A reação é cessada pela adição de 2,0 ml de bicarbonato de sódio a 10% (ZAIA, 1998). RESULTADOS E DISCUSSÃO Neste trabalho, os frutos oleaginosos foram obtidos de uma propriedade rural no município de Gurupi estado do Tocantins. Basicamente utilizamos caroços de Tamarindus indica L.(Tamarindo) e Mangifera indica L. (Manga) foi realizada a raspagem das sementes para a obtenção dos micro-organismos, posteriormente isolados e inoculados em meio de cultura adequado como citado anteriormente. Foram isoladas colônias de bactérias e leveduras de pastilha para degradação de gordura contendo micro-organismos vivos para a medição da atividade lipolítica. Todas as linhagens de leveduras e bactérias foram analisadas e selecionadas quanto à produção de lipase, de acordo com a sua coloração após a adição de bicarbonato de sódio a 10% aos poços das placas, 16 cepas foram selecionadas: D4, B6, C6, B4, C2, A4, A2, A6, 2C, 2D, 4C, 6A, 2B, 2C, 4A, 4B, sendo que as linhagens C2 e A4 foram utilizadas como controle. O ensaio de lipase foi realizado utilizando Palmitato de p-nitrofenila como substrato, a atividade total da enzima foi então calculada resultando no gráfico a seguir:

5 Figura 1. Gráfico atividade total da enzima U/mL. Pela figura 1, analisando o perfil geral de atividade lipolítica, podemos observar a alta atividade da linhagem isolada M-2C (Manga) seguida da cepa I-B6 (pastilha degradadora de gordura). O resultado desse valor se tratando da fruta oleaginosa (Manga) de certo modo era previsível, pois o caroço da manga é utilizado como fonte de lipídios. Este resultado pode ter ocorrido devido à raspagem direta do caroço para a obtenção das linhagens. Os valores da pastilha foram relativamente mais favoráveis em relação ao Tamarindo, isto pode ter ocorrido pelo fato da pastilha conter cepas com boa produção de lipase para sua devida função de degradar gordura. LITERATURA CITADA OLIVEIRA, L.G., MANTOVANI, S.M. Transformações Biológicas: Contribuições e Perspectivas. Química Nova, vol. 32, no.3, , ZAIA, D.M.A., ZAIA, C.T.B.V., LICHTIG, J. Determinação de proteínas totais via espectrofotometria: vantagens e desvantagens dos métodos existentes. Química Nova, v.21, n.6, p , AGRADECIMENTOS "O presente trabalho foi realizado com o apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CNPq Brasil"

Documentos relacionados

PROSPECÇÃO DE FUNGOS LIPOLÍTICOS DO ESTADO DO TOCANTINS PROMISSORES EM APLICAÇÕES INDUSTRIAIS PROPESQ GU3 # 003/2010

PROSPECÇÃO DE FUNGOS LIPOLÍTICOS DO ESTADO DO TOCANTINS PROMISSORES EM APLICAÇÕES INDUSTRIAIS PROPESQ GU3 # 003/2010 Leonardo Alves dos Santos 1 ; Ezequiel Marcelino da Silva 2. 1 Aluno do curso de Engenharia