Por que razão devemos comer fruta? Determinação da capacidade antioxidante da pêra abacate.

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1 Instituto Superior de Engenharia do Porto Departamento de Química Laboratório de Investigação GRAQ Por que razão devemos comer fruta? Determinação da capacidade antioxidante da pêra abacate. Lara Sofia Pinto Sá Neves Junho 2018

2 Introdução Sabemos que é muito importante o consumo de fruta pelo facto de possuir grande valor nutricional e benefícios para a nossa saúde. As propriedades nutritivas destes alimentos advém da presença de compostos bioativos, tais como os antioxidantes. Durante as reações de respiração celular que ocorrem no nosso organismo são gerados radicais livres, compostos fortemente reativos com um eletrão desemparelhado e muito instáveis. Quando produzidos em excesso, podem provocar danos em estruturas das células (como o ADN, proteínas e membrana celular) originando doenças. A presença de antioxidantes nas células promove a proteção das biomoléculas neutralizando os radicais livres e evitando a oxidação de estruturas do organismo, ajudando a manter o sistema imunológico dos seres vivos. São exemplos de famílias de compostos antioxidantes, o ácido ascórbico (ou vitamina C), os compostos fenólicos (como por exemplo o ácido gálico) e os flavonóides (tal como a epicatequina). Perante o reconhecimento da importância da fruta como fonte externa de compostos bioativos, muitos investigadores têm desenvolvido métodos analíticos para caracterizar e quantificar o perfil de antioxidantes de alimentos. A nível laboratorial, os passos a seguir compreendem a i) extração dos compostos bioativos existentes no alimento, seguido de ii) a aplicação do procedimento analítico mais adequado para o que se pretende determinar. As metodologias mais usadas para a quantificação da capacidade antioxidante de uma substância são a espectrofotometria de UV-Vis (método colorimétrico) e a cromatografia liquida. Neste estágio Ciência Viva, aprofundei os meus conhecimentos sobre i) métodos de extração; ii) fatores que afetam a eficiência da extração; iii) o que são antioxidantes iv) métodos analíticos para a determinação do teor fenólico total (TFeT) e de flavonoides total (TFlT) e v) cromatografia liquida para a determinação dos antioxidantes. Para além disso, adorei estar uma semana num laboratório de investigação, de ver e contactar com o dia-a-dia dos investigadores.

3 Objetivos Este trabalho teve por objetivo a determinação do TFeT e do TFlT e do perfil de antioxidantes da pera abacate. Para isso, realizaram-se as seguintes etapas: 1. Preparação da amostra; 2. Extração de compostos bioativos da amostra usando uma extração sólido-líquido; 3. Determinação do TFeT (pelo método do Folin-Cioucalteu); 4. Determinação do TFlT (pelo método do cloreto de alumínio); 5. Determinação do teor de ácido gálico e catequina por cromatografia líquida de alta eficiência com deteção ultravioleta (HPLC-UV); 6. Elaboração de um poster com os resultados obtidos. Parte experimental 1. Preparação das amostras 1.1 Lavar e preparar a pera abacate; 1.2 Triturar e homogeneizar a amostra; 1.3 Pesar rigorosamente 2 g da amostra para um tubo de ensaio; 1.4 Adicionar 20 ml de solvente (ver tabela 1); 1.5 Centrifugar os extratos (9000rpm, 30min, 40 C) 1.6 Recolher o sobrenadante para um novo tubo; 1.7 Diluir os extratos obtidos na proporção de 1:10; 1.8 Conservar a -20 C até análise; Tabela 1 - Proporção de solvente Código Solvente (água:etanol) 1F 100:0 2F 50:50 3F 0: Métodos Analíticos 2.1 Determinação do teor em compostos fenólicos (método Folin- Ciocalteu) Este método utiliza o reagente de Folin-Ciocalteu (uma mistura de ácidos fosfomolíbdico e fostotúngstico) que por meio de uma reação de oxidação-redução, que ocorre em meio básico, é reduzido e os fenóis existente na amostra são oxidados

4 (Equação 1 e 2). A coloração desenvolvida é proporcional ao teor de compostos fenólicos, e é medida através da absorvância a 765 nm. Na 2WO 4/Na 2MoO 4 (fenol MoW 11O 4) -4 (Equação 1) Mo(VI) (amarelo) + e - Mo(V) (azul) (Equação 2) Para a determinação do TFeT, 25 µl de antioxidante padrão (ácido gálico) ou extratos (soluções obtidas na tabela 1), ou água desionada (branco) foram adicionada a uma microplaca de 96 poços. De seguida adicionou-se 75 µl de água desionada e 25 µl de reagente Folin-Cioucalteu. Após um período de repouso (5 minutos) ao abrigo da luz, adicionou-se 100 µl de Na 2CO 3 (75 g L -1 ) e deixou-se repousar ao abrigo da luz e à temperatura ambiente por 90 minutos. De seguida as leituras das absorvâncias foram realizadas ao comprimento de onda de 760 nm. As curvas de calibração foram realizadas usando-se o ácido gálico, como antioxidante padrão, na gama de concentrações a variar de 10 a 200 µg ml Determinação do teor em flavonoides totais A determinação do TFlT (sub família dos compostos fenólicos) baseia-se na capacidade que o AlCl 3 tem em formar complexos estáveis com os compostos flavonoides. Este deteção é efetuada ao comprimento de onda de 510 nm. Na determinação do teor de flavonoides total colocou-se numa microplaca de 96 poços, 25 µl de amostra (extrato obtido da pera abacate) ou 25 µl de água ou 25 µl de epicatequina (antioxidante padrão representante dos flavonoides), 100 µl de água e 10 µl de NaNO 2 (5 %). Passado 5 minutos, adicionou-se 15 µl de AlCl 3 ( 10 %). Seguidamente, e ao fim de 1 minuto adicionou-se 50 µl de NaOH (1 mol L -1 ). As leituras da absorvância foram realizadas ao comprimento de onda de 510 nm. As curvas de calibração foram realizadas usando-se a epicatequina, como representante dos flavonoides, na gama de concentrações de 10 a 200 µg ml Análise cromatográfica De modo a conhecer e identificar individualmente os antioxidantes presentes na pera abacate, os extratos obtidos na extração sólido-liquido do abacate foram analisados por cromatografia liquida. A deteção e a quantificação dos compostos fenólicos foi realizada a 280 nm, e os analitos em cada extrato foram identificados por comparação dos seus tempos de retenção e espectros UV-Vis com os dos padrões de ácido gálico e catequina.

5 Resultados e discussão Neste estágio CIÊNCIA VIVA determinou-se o teor fenólico e de flavonoides total (TFeT e TFlT) amostras de pera abacate. De modo a estudar o efeito do tipo do solvente na eficiência da extração sólido-liquido, foram usadas misturas constituídas por 100 % de água, 100 % de etanol e 50:50 água: etanol. As extrações foram realizadas ao abrigo da luz, à temperatura de 40 ºC e durante 30 minutos. Na tabela 2 apresentam-se os resultados obtidos nestas análises. Conforme se pode visualizar na Tabela 2, os valores de TFeT variaram entre 38 e 64 µg EAG ml -1 e os teores de TFlT entre 18 e 40 µg EEPI ml -1. Os valores mais altos de fenóis e flavonoides foram obtidos foram se utilizou uma mistura de 50:50 em água e etanol. Assim sendo pode-se considerar que quando se usa uma mistura entre solventes aquosos e solventes orgânicos consegue-se extrair mais compostos bioativos. Tabela 2: Valores de TFeT e TFlT obtidos para os extratos da pera abacate. Amostra nº Solventes (água: etanol) TFeT µg EAG ml -1 TFlT µg EEPI ml -1 1F 100: 0 38,4 ± 2,1 24,1 ± 1,9 2F 50: 50 34,7 ± 1,3 18,3 ± 0,7 3F 0: ,3 ± 3,2 40,5 ± 2,4 Relativamente às análises cromatográficas, verificou-se que de uma forma rudimentar que os extratos da pera abacate contêm compostos fenólicos e flavonoides, tais como ácido gálico, ácido cafeico e epicatequina.

6 CONCLUSÕES Com este estágio, pude concluir que a pera abacate tem antioxidantes sendo muito benéfica para a saúde. Contém também ácidos gordos essenciais como demonstrado no ponto da cromatografia gasosa. Comprovamos que é uma boa ideia comer abacate e aproveitar os resíduos de indústrias para valorização dos produtos com compostos benéficos para a saúde, contribuindo para a sustentabilidade ambiental e redução de desperdícios. Anexo 1 Poster com resultados obtidos

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