DETECÇÃO DE LÍPASE POR CEPA DE Rhizopus arrhizus var. arrhizus

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1 DETECÇÃO DE LÍPASE POR CEPA DE Rhizopus arrhizus var. arrhizus Santos Cordeiro, C.C. (1) ; Lima, J. M. M. (2) ; Lima, B.F. (1) ; Correia, M. A. B. (1) ; Andrade Silva, N. R. (1) ; Sá Muniz, M. C. (1) ; Souza D.G. (1) ;Rocha Moura, C. M.; Lima, J. M. M. (2) ; Alves da Silva, C.A. (1) cidaliacordeiro@hotmail.com (1) Universidade Católica de Pernambuco - UNICAP, Recife - PE, Brasil; (2) Universidade Federal de Pernambuco - UFPE, Recife - PE, Brasil. RESUMO Lipases pertencem ao grupo das hidrolases que catalisam a conversão de triacilgliceróis a ácidos graxos livres e glicerol. Possuem significante potencial biotecnológico como catalisadores em reações de síntese orgânica em meio não aquoso utilizando processos simplificados com altos rendimentos. A produção de lipases tem sido realizada, usualmente, por processo fermentativo submerso; entretanto, o processo em fase sólida também tem se mostrado promissor, quando são utilizados resíduos como fontes de substrato que são nutrientes de baixo custo.o Rhizopus arrhizus var.arrhizus isolado do solo da Caatinga de Pernambuco representa um gênero de fungos filamentosos com um elevado potencial biotecnológico na produção de ácidos orgânicos e enzimas. foi realizado inoculado em meio de esporulação (YMA extrato de malte, extrato de levedura, peptona, glicose e ágar ) por 96h em seguida foi realizado a suspensão de esporos 10 7 ml/esporos e inoculado 5% da suspensão nos meios de produção com soro de leite (5%, 10% e 20%) acrescido do indutor tween 80 mas 0,1% de nitrato de sódio (NaNO3), 0,1% de fosfato de potássio monobásico (KH2PO4), 0,05% de sulfato de magnésio (MgSO4.7H2O). O ph foi ajustado a 6,5 com H2SO4 1,5 M. Os experimentos foram realizados em duplicata em Erlenmeyers de 500 ml, com volume inicial de meio de 200 ml, e mantidos em agitador orbital a 28 C por 216

2 horas, com agitação de 150 min 1. Amostras foram coletadas no tempo inicial de 24 horas por 9 dias para determinação da atividade lipolítica.na fermentação submersa, a cepa do Rhizopus arrhizus var. arrhizus de acordo com o resultado obtido foi observado produção de lípase com a presença do indutor. Palavras-chave: Produção Enzimática, Enzima, Caatinga. INTRODUÇÃO A tecnologia enzimática é hoje um dos campos mais promissores dentro das novas tecnologias para síntese de compostos de alto valor agregado (LIMA,2012). Segundo Salum (2010), as enzimas são catalisadores biológicos que possuem diversas vantagens em relação aos catalisadores químicos, como a alta seletividade para determinados substratos, a sua versatilidade (podem atuar em amplas faixas de ph e temperatura) e a sua biodegradabilidade. Dentre as enzimas mais utilizadas estão as lípases (glicerol éster hidrolases E. C ), que são muito empregadas pela indústria química, farmacêutica, alimentícia, cosmética, entre outras. Portanto, as lipases têm as aplicações clássicas baseadas em processos que utilizam reações de hidrólise de triacilgliceróis, mas a sua utilização em meios orgânicos (ambientes aquo-restritos), tem possibilitado o seu uso em reações de síntese de ésteres. Os ésteres são amplamente utilizados em diversas áreas, por exemplo, como aditivos em combustíveis, emolientes em cosméticos, drogas, biopolímeros e herbicidas. 2

3 Convencionalmente, as lípases são produzidas por micro-organismos por processos de fermentação submersa (FS), que apresentam as vantagens de maior facilidade de controle do processo e bons rendimentos para a produção de enzimas extracelulares. A economia do processo deve-se à possibilidade da utilização de resíduos agroindustriais como substrato. A aplicação de resíduos em bioprocessos,ajudando na resolução de problemas de poluição causados pelo despejo de rejeitos agroindustriais na natureza promovendo substratos alternativos de baixo custo,tornado-se economicamente viável em países que são grandes produtores agrícolas, como o Brasil (SALUM, 2010). O reconhecimento dessas vantagens tem proporcionado um aumento considerável na produção e comercialização de lípases,resultando no desenvolvimento de tecnologias alternativas consistentes para utilização no setor industrial (ROVEDA, 2010; CASTRO, 2004). O objetivo deste trabalho foi produzir lípases via fermentação submersa utilizando fungo selecionado do banco do Laboratório do Núcleo de Pesquisa de Processos Ambientais Universidade Católica de Pernambuco, utilizando como meio resíduo de soro de leite. 3

4 MATERIAL E MÉTODOS Isolamento, identificação e seleção de fungos produtores de lípases Os fungos já estavam previamente isolados, identificados e selecionados do bancos de micro-organismos do Laboratório do Núcleo de Pesquisa de Análise Processo Ambientais. Produção de lípases via fermentação submersa Micro-organismos Os fungos selecionados no item 2.1 foram utilizados para a produção de lípases via fermentação submersa. Preparo do inoculo O preparo dos inoculos foi realizado em placas de Petri contendo o meio YMA utilizando os fungos que apresentaram maiores velocidades de crescimento radial. O inoculo foi incubado durante 7 dias em estufa a 30 C. Após o crescimento, foi preparada uma suspensão de esporos através da adição de 20 ml de uma solução de 0,1% de emulsificante Tween 80 (Synth), seguida de raspagem dos esporos com uma alça de Drigalsky. A inoculação dos meios foi realizada adicionando-se 5 ml de solução de esporos para cada 200 ml de meio de cultivo. 4

5 Meio de cultivo e condições experimentais O meio de cultivo utilizado nas fermentações foi o resíduo de soro de leite em concentrações variadas 5%,10% e 20% ao qual se adicionaram os seguintes nutrientes: 0,1% de nitrato de sódio (NaNO3), 0,1% de fosfato de potássio monobásico (KH2PO4), 0,05% de sulfato de magnésio (MgSO4.7H2O) e 1% de Tween 80 como indutor. O ph foi ajustado a 6,5 com H2SO4 1,5 M. Os experimentos foram realizados em duplicata em Erlenmeyers de 500 ml, com volume inicial de meio de 200 ml, e mantidos em agitador orbital a 28 C por 216 horas, com agitação de 150 min 1. Amostras foram coletadas no tempo inicial de 24 horas por 9 dias para determinação da atividade lipolítica. Determinação da atividade lipolítica A atividade enzimática de lipase foi detectada através da metodologia descrita por Soares et al. (1999). Foi realizada uma reação de uma mistura contendo 5 ml de uma emulsão de óleo de oliva e goma arábica (7%), 2 ml de tampão fosfato de sódio (0,1 M) ph 7,0 e 1 ml do extrato bruto filtrado da lipase produzida na encubação em meio líquido. A mistura foi agitada em shaker orbital a 82 rpm, 37 ºC, durante 10 minutos. A reação foi parada através da adição de 10 ml de uma mistura acetona-etanol-água (1:1:1), que irá liberar os ácidos 5

6 graxos livres presentes na mistura, e titulado com uma solução de KOH (0,04 N) na presença do indicador fenolftaleína. Os ensaios foram realizados em triplicatas e a atividade enzimática foi determinada através da seguinte relação: uma unidade da atividade lipolítica (U/mL) será definida como a quantidade da enzima bruta que liberou 1 µ/ml de ácido graxo por minuto. Cálculo da atividade enzimática A atividade enzimática de lipase foi calculada através da equação seguinte equação: AE (U/mL) = (Va-Vb) x N x 1000 t x Vc Onde: AE é a atividade lipolítica (U/mL); Va é o volume da amostra titulada (ml); Vb é o volume da amostra utilizado na reação (ml); N é a normalidade da solução de KOH (mol/l); t é o tempo de reação em minutos (SOARES, et al, 1999). RESULTADOS E DISCUSSÃO As lipases podem ser de origem vegetal, animal ou microbiana, sendo as últimas as mais utilizadas. Dentre as enzimas microbianas, as produzidas por fungos são especialmente valorizadas por serem 6

7 extracelulares, o que facilita sua recuperação do meio de cultivo. Os fungos filamentosos têm sido estudados como bons produtores de lipases, sendo os gêneros mais citados Aspergillus, Rhizopus, Penicillium, Mucor, Geotrichum e Fusarium (COLLA;REINEH;COSTA,2012). Na produção de biomassa em diferentes concentrações 5%,10% e 20% (Figura 1) verificou-se que o fungo Rhizopus arrhizus var. arrhizus obtive melhor rendimento de biomassa na concentração de 20% de soro de leite.o Rhizopus arrhizus var. arrhizus apresentou uma fase lag ou de adaptação de 24h, que um período crítico, onde o micro-organismo sintetiza as enzimas necessárias ao metabolismo dos componentes presentes no meio. Conforme Hiss(2001) os fungos filamentosos não apresenta a fase logarítmica passando logo para a estacionária, onde há um balanço entre a velocidade de crescimento e o velocidade de morte celular, causando uma desaceleração e acúmulo de metabólitos, no entanto o Rhizopus arrhizus var. arrhizus apresentou uma fase logarítmica com 48h de cultivo e entrando na estacionária com 72 h de cultura. 7

8 Figura 1. Produção de biomassa em diferentes concentrações 5%,10% e 20. As lipases microbianas são produzidas principalmente em cultivos submersos (COLLA;REINEH;COSTA,2012). A atividade lipolítico apresentada pelo o Rhizopus arrhizus var. arrhizus (Figura 2) não foi significativo em relação as literaturas revisadas, apresentou um maior pico de atividade em 120 h na concentração de 20% de soro de leite com a produção de 11,60 U/mL. No entanto alguns fatores podem afetar a produtividade destes bioprecessos são principalmente os tipos de concentrações de nutrientes, o ph e a presença de concentrações de indutores, agitação e temperaturas entre outros. 8

9 Figura 2. Atividade lipolítico apresentada pelo o Rhizopus arrhizus var. arrhizus CONCLUSÃO A realização de pesquisas que utilizam micro-organismos isolados de novos ambientes, bem como a utilização de resíduos agroindustriais na composição dos meios é necessário, a fim obter elevadas produtividades a custo menores, e fatores que possam afetar a produtividade passe ser controlados, minimizando os erros. REFERÊNCIAS CARVALHOS,P.O.et al. Potencial de biocatálise enantiosseletiva de lipase microbianas. Química Nova,v.28,n.4,p ,2005. CASTRO, H. F. et al. Modificação de óleos e gorduras por biotransformação. Química Nova, v. 27, n. 1, p , COLLA,M.L.;REINEHR,C.O.;COSTA,J.A.V.Aplicação e Produção de Lipase Microbiana.Revista CIATEC-UPF,V.4(2),P.1-14,

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11 SALUM,T.F.C. Produção e Imobilização de lípases de Burkholderia cepacia LTEB11 para síntese de ésteres etílicos.paraná.2010.tese-universidade Federal do Paraná. 11