UTILIZAÇÃO DE RESÍDUOS DA AGROINDÚSTRIA PARA A PRODUÇÃO DE ENZIMAS LIPOLÍTICAS POR FERMENTAÇÃO SUBMERSA

Transcrição

1 19 ISSN UTILIZAÇÃO DE RESÍDUOS DA AGROINDÚSTRIA PARA A PRODUÇÃO DE ENZIMAS LIPOLÍTICAS POR FERMENTAÇÃO SUBMERSA Anne Caroline Defranceschi Oliveira 1, José Viriato Coelho Vargas 2, Maria Luiza Fernandes Rodrigues 3, André Bellin Mariano 4 RESUMO Lipases são enzimas capazes de clivar a ligação éster de triacilgliceróis, e em condições favoráveis realizam uma série de reações de síntese, como as de esterificação e transesterificação. As lipases microbianas são as mais comumente usadas, pois possuem algumas características interessantes para seu emprego em meio orgânico. O objetivo deste trabalho foi otimizar a produção de lipases da levedura endofítica de Candida guilliermondi através de planejamento experimental. O planejamento Plackett-Burman foi aplicado, utilizando 6 variáveis da composição do meio de cultivo e a variável inóculo. As variáveis glicerol e sulfato de amônio foram as que mais apresentaram efeitos sobre a secreção da enzima no meio, 7,2775 ±1,58 e 9,9225 ±1,58 U.mL -1, respectivamente. O experimento em que todas as variáveis estavam no nível alto apresentou a maior secreção de lipases, 27,42 U.mL -1, confirmando os resultados obtidos na análise estatística para as variáveis. Com os resultados obtidos é possível concluir que esta cepa endofítica de levedura é um micro-organismo promissor para obtenção de lipases, e a técnica de planejamento experimental é uma valiosa ferramenta para otimização de produção de metabolitos, como as enzimas. Palavras chave: lipase, levedura endofítica, resíduos agroindustriais. USE OF AGROINDUSTRIAL WASTE FOR ENZYME PRODUCTION BY SUBMERGED FERMENTATION ABSTRACT Lipases are enzymes capable to cleave the ester bound of triacylglycerides and under favorable conditions they can perform synthesis reactions such as esterification and transesterification. The microbial lipases are the most used ones because they have some interesting features for its use under organic media. This work aim was to optimize the lipase production from an endophytic strain of Candida guilliermondi by experimental design. The Plackett Burman design was applied with 6 variables of medium composition and inoculum. The variables glycerol and ammonium sulfate showed the greatest effect over the enzyme secretion, 7,2775 ±1,58 and 9,9225 ±1,58 U.mL -1, respectively. The experiment with all variables at highest level had the greatest lipase secretion, 27,42 U.mL -1, confirming the results obtained at the variable statistical analysis. With the obtained results it is possible to conclude that this endophytic yeast strain is a promising microorganism for lipase obtainment and the experimental design is a valuable tool to optimize the metabolite production, like enzymes. Keywords: lipase, endophytic yeast, agroindustrial waste. Protocolo de 15/03/ Biotecnóloga, Mestranda em Engenharia e Ciência dos Materiais. Setor de Tecnologia, Universidade Federal do Paraná, CP 19011, , Curitiba PR, Brasil. annewcaroline@hotmail.com (41) PhD em Engenharia Mecânica. Setor de Tecnologia, Universidade Federal do Paraná, CP 19011, , Curitiba PR, Brasil. 3 Doutora em Química Orgânica. Universidade Tuiuti do Paraná, , Curitiba PR, Brasil. 4 Doutor em Bioquímica. Setor de Tecnologia, Universidade Federal do Paraná, CP 19011, , Curitiba PR, Brasil.

2 20 Utilização de resíduos da agroindústria para a produção de enzimas lipolíticas por fermentação submersa Oliveira et al. INTRODUÇÃO Lipases (EC ) são enzimas hidrolíticas que na presença de água clivam a ligação éster de triacilgliceróis (Fernandes et al., 2007). Na ausência de água, estas enzimas podem realizar uma série de reações de interesse industrial como a de esterificação e a de transesterificação, dentre outras (Jaerger & Reetz, 1998; Sharma et al., 2001). As lipases, como todas as enzimas, são catalisadores que possuem características muito interessantes como a seletividade, a especificidade, além da possibilidade da reutilização (Dalla-Vecchia et al., 2004). Seu uso na geração de biodiesel, uma das utilizações mais investigadas, ainda não é difundida para uso industrial, e um dos motivos para isto é o alto custo para obtenção destes catalisadores (Silva et al., 2011). As enzimas lipolíticas microbianas são as que mais têm potencial para aplicação em biocatálise por algumas razões, como a capacidade de adaptação em sistemas orgânicos, e não necessitar de cofatores (Hasan et al., 2006). Para baratear a produção destas enzimas algumas estratégias podem ser adotadas, como a substituição dos componentes do meio de cultivo por materiais de baixo custo ou até mesmo resíduos. A agroindústria dispensa toneladas de resíduos, que aparentemente não tem função, porém são materiais ricos em nutrientes como proteínas, carboidratos, lipídios e sais minerais, dentre outras substâncias de interesse, que podem ser facilmente metabolizados por cepas microbianas (Pandey et al., 1999ª; Sharma et al., 2001; Damaso et al., 2008). Dois diferentes processos fermentativos podem ser empregados para obtenção de enzimas microbianas: a fermentação no estado sólido (FES) e a fermentação submersa (FSm). A diferença destes dois processos é que na FES um suporte sólido é utilizado para o crescimento microbiano. Este suporte pode ser sintético, como no caso da espuma de poliuretano, mas geralmente ele é natural, como o bagaço de cana de açúcar ou mesmo tortas, como a de soja, obtidas da prensagem de oleaginosas para extração de óleo (Couto et al., 2005; Fernandes et al., 2007). A fermentação submersa consiste na solubilização dos nutrientes para a fermentação em meio liquido. Neste processo também podem ser utilizados resíduos para a produção de enzimas, como o glicerol, que é subproduto da reação de transesterificação do biodiesel, sendo facilmente metabolizado por muitos microorganismos (Champe et al., 2009). A escolha do meio fermentativo para a produção de lipases deve levar em conta alguns fatores que visem propiciar ao micro-organismo o ambiente o mais favorável possível para a realização do processo, um deles é o ambiente físico do meio (sólido ou liquido) que varia para cada tipo de micro-organismo. Os fungos tem maior capacidade de crescimento em fermentação sólida, pois esta simula bem o ambiente em que naturalmente são encontrados, enquanto bactérias e leveduras, devido ao ser caráter unicelular tem maior habilidade em absorver nutrientes do meio líquido (Sharma et al., 2001; Li & Zong, 2010). Outro ponto importante do desenvolvimento do meio fermentativo é a sua composição química. Para uma satisfatória secreção de lipases é necessário uma fonte de carbono e nitrogênio facilmente metabolizável pela cepa, para que esta apresente ideal crescimento, mas quando fala-se em produção de lipases o indutor é um ponto crucial para o sucesso da fermentação. Lipases são enzimas de caráter indutivo, e a escolha do indutor ideal é o determina a produtividade do biocatalisador (Contesini et al., 2010; Iftikhar et al., 2010; Li & Zong, 2010). As matérias primas utilizadas como indutores para a produção de lipases são geralmente óleos, sendo o principal o óleo de oliva, devido a sua grande proporção de trioleína, substrato ideal para muitas lipases. Quando se pensa em produção em larga escala o uso de um substrato de alto custo pode ocasionar um grande aumento do valor do produto final, portanto o barateamento deste componente do

3 Utilização de resíduos da agroindústria para a produção de enzimas lipolíticas por fermentação submersa Oliveira et al. 21 meio se faz importante (Fernandes, 2006; Damaso et al., 2008). O objetivo deste trabalho foi utilizar resíduos agroindustriais e substratos de baixo custo para otimizar a produção de lipases de uma cepa endofítica de Candida guilliermondi através de planejamento experimental. Micro-organismo MATERIAIS E MÉTODOS A cepa de levedura Candida guilliermondi utilizada neste trabalho foi isolada das folhas de mamona pelo Biotecnólogo Jean Figueiredo, da Universidade Tuiuti do Paraná. A cepa foi mantida em tubo inclinado contendo meio batata dextrose ágar, e foi repicada a cada 15 dias, para sua manutenção. Preparo do inóculo A levedura foi inoculada em meio contendo 15 g.l -1 de levedo de cerveja e 10 g.l - 1 de sacarose, sendo incubada em shaker a 30ºC por 48 horas com agitação de 180 rpm. A concentração de células foi determinada por contagem em câmara de Neubauer. Otimização da produção de lipases utilizando planejamento experimental Plackett-Burmam O processo de fermentação submersa (FSm) foi escolhido para a obtenção das enzimas. Na composição do meio de cultivo foram escolhidos substratos de baixo custo, como os resíduos glicerol e levedo de cerveja, além do óleo de soja, que representa uma diminuição nos custos de produção de lipases, que geralmente requerem óleo de oliva como indutor. A fermentação foi conduzida em frascos erlenmeyers de 250 ml, contendo 150 ml de meio de fermentativo. Todos os meios foram solubilizados em tampão fosfato 25 mm ph 6,5. As fermentações foram conduzidas em shaker a 30ºC e 180 rpm por 72 horas. Para otimizar a produção foi realizado um planejamento experimental do tipo Plackett- Burman, empregando as variáveis da composição do meio de cultivo: tween 80, glicerol, levedo de cerveja, óleo de soja, sulfato de manganês, sulfato de amônio e uma que envolve a concentração do inóculo. Todos os meios foram esterilizados em autoclave, e após atingir temperatura ambiente foram acrescidos do inóculo. Os níveis das variáveis podem ser observados na tabela 1. A variável resposta escolhida foi a atividade enzimática em U.mL -1 de cada meio fermentado. A análise gráfica e o delineamento experimental foram realizados pelo software Statistica 7.0. Tabela 1. Níveis propostos para as variáveis do planejamento experimental. Variável Tween Glicerol Levedo de cerveja Óleo de soja 15 27,5 40 Sulfato de Manganês Sulfato de amônio 0,05 0,125 0, Inóculo 10 9 cél cél cél *Todas as variáveis são dadas em g.l -1, exceto a variável inóculo que é dada em número de células. Ensaio enzimático A atividade enzimática do meio fermentado foi determinada pelo método de hidrólise do pnpp (p-nitrofenil palmitato), descrito por Ghori et al. (2011), com adaptações. 100 µl do meio fermentado foram incubados com 800 µl de solução de PVA (álcool polivinílico) 0,25% em tampão fosfato ph 6,5 e 100 µl de solução de pnpp 8 mm em isopropanol. Após incubação a 30ºC a reação foi paralisada com 500 µl de HCl 3 M. O meio reacional foi centrifugado e 500 µl do

4 22 Utilização de resíduos da agroindústria para a produção de enzimas lipolíticas por fermentação submersa Oliveira et al. sobrenadante foram adicionados a 1 ml de NaOH 2 M. A leitura foi realizada a 410 nm. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a liberação de 1 µmol de p- nitrofenol por minuto. Análise estatística Os coeficientes (C i) do planejamento experimental foram calculados através da fórmula 1. (1) Onde C i é o coeficiente do fator i e U é a atividade enzimática. A i e B i apresentam os níveis altos e baixos do parâmetro i, respectivamente. RESULTADOS E DISCUSSÃO A utilização da ferramenta planejamento experimental visou determinar as melhores condições para a produção de lipases com um pequeno número de experimentos. Os resultados de cada experimento podem ser observados na Tabela2. É possível observar que em todos os tratamentos houve a secreção de enzimas lipolíticas. Na Tabela 3 é possível observar os efeitos gerados por cada variável sobre a produção da enzima. De acordo com a análise estatísticas apenas a variável tween 80 não gerou efeito, enquanto que as variáveis óleo de soja e inóculo, apresentaram uma pequena significância, pois se encontram muito próximas ao desvio padrão. A presença de um indutor é essencial para a secreção de lipases. Os dois indutores (tween 80 e óleo de soja) não apresentaram grande significância nos níveis testados, apontando que a faixa utilizada no experimento foi satisfatória desde o nível baixo. Tabela 2. Matriz do planejamento experimental e resultados obtidos. Exp. Tween 80 Glicerol Levedo Óleo Mn Sulfato amônio Inóculo Atividade (U.mL -1 ) , , , , , , , , , , ,07 As variáveis glicerol, levedo de cerveja, sulfato de manganês e sulfato de amônio apresentaram os coeficientes mais expressivos. Este resultado de fato pode ser observado nos

5 Utilização de resíduos da agroindústria para a produção de enzimas lipolíticas por fermentação submersa Oliveira et al. 23 resultado obtidos em cada experimento. O experimento 8, onde todas as variáveis estavam no nível alto apresentou a melhor condição para secreção de lipases. Todos os coeficientes que apresentaram significância estatística estavam no nível alto. Os experimentos 2 e 5 apresentaram as menores atividades enzimáticas (8,57 e 7,03 U.mL -1, respectivamente) e este fato esta relacionado, em ambos os experimentos, com a combinação de 3 das 4 variáveis mais significativas estarem em níveis opostos aos observados como ótimos neste experimento. Tabela 3. Estimativa dos coeficientes das variáveis para a produção de lipases. Variável C i Tween 80-0,9025 Glicerol 7,2775 Levedo de cerveja 5,4925 Óleo de soja 1,9875 Sulfato de Manganês 4,0925 Sulfato de amônio 9,9225 Inóculo -1,9475 * O desvio padrão obtido foi de ±1,58 U.mL -1. Os fatores que envolviam as fontes de carbono e nitrogênio do experimento (glicerol, (A) levedo de cerveja e sulfato de amônio) foram as variáveis que apresentaram maior importância na secreção das enzimas lipases, sendo que, quando o glicerol foi aumentado do nível baixo para o nível alto houve um acréscimo de atividade de 7,2775 ± 1,58 U.mL -1, para o levedo de cerveja o acréscimo foi de 5,4925 ± 1,58 U.mL -1 e para o sulfato de amônio foi de 9,9225 ± 1,58 U.mL -1. Os gráficos de superfície de resposta gerados para estas variáveis podem ser observados na Figura 1. Estes resultados são de suma importância, uma vez que os dois resíduos utilizados no meio de cultura foram duas das variáveis de maior importância. O glicerol pode ser facilmente absorvido por alguns micro-organismos, uma vez que este tem livre passagem pela membrana celular, tornando-se uma fonte de energia de fácil absorção (Champe et al., 2009). Uma fonte de carbono facilmente metabolizável é imprescindível para a secreção de metabólitos, como é o caso de enzimas, pois com a fácil metabolização desta fonte de carbono ocorre um crescimento celular mais acelerado no meio, aumentando assim o número de células aptas a consumir o indutor e secretar o metabólito de interesse mais facilmente (Kamini et al., 2000; Fernandes, 2006). Levedo Atividade Figura 1. Superfície de resposta das variaveis: A- levedo e glicerol, B- glicerol e sulfato de amônio e C- sulfato de amônio e levedo de cerveja. Glicerol > < 0.7 < 0.5 < 0.3 < 0.1 < -0.1 < -0.3 < -0.5 < -0.7

6 24 Utilização de resíduos da agroindústria para a produção de enzimas lipolíticas por fermentação submersa Oliveira et al. (B) Sulfato Atividade Glicerol > 1.5 < 1.1 < < 0.1 < < -0.9 < -1.4 (C) Sulfato Atividade continuação Figura 1. Superfície de resposta das variaveis: A- levedo e glicerol, B- glicerol e sulfato de amônio e C- sulfato de amônio e levedo de cerveja. Levedo > 1.4 < 1.3 < 0.9 < 0.5 < 0.1 < -0.3 < -0.7 < -1.1 Os dois resíduos apresentaram um grande enriquecimento ao meio de cultivo, não só pelo aumento da atividade enzimática obtida, mas também pelo fato de apresentar uma boa diminuição nos custos deste meio e representar a absorção destes resíduos de uma forma nobre, gerando um produto de grande valia como são as enzimas (Pandey et al., 1999 b ; Fernandes, 2006). Damasso et al. (2008) produziu lipases fúngicas utilizando como indutor resíduos do processamento do óleo de milho. Um dos resíduos foi capaz de induzir uma secreção de lipases 30% maior que a observada quando utilizado o óleo de oliva, tido como o indutor ideal para lipases. Estes resultados apontam a riqueza de nutrientes que materiais tidos como resíduos podem apresentar.

7 Utilização de resíduos da agroindústria para a produção de enzimas lipolíticas por fermentação submersa Oliveira et al. 25 Salihu et al. (2011) também utilizou resíduos para a obtenção de lipases de Candida cylindracea, obtendo bons resultados com a fermentação utilizando resíduos do processamento do óleo de palma. O sulfato de amônio foi a variável que apresentou o maior coeficiente, 9,9225 ±1,58 U.mL -1, ou seja, quando aumentado do nível baixo pra o nível alto pode-se obter um ganho de quase de 10 U.mL -1 de atividade. O sulfato de amônio é uma substância muita utilizada em meios fermentativos, pois o amônio é facilmente absorvido pelos micro-organismos, tornando-se essencial no metabolismo proteico deste (Guimarães, 2005). Lima et al. (2003) avaliou diversas fontes de nitrogênio para a produção de lipases de uma cepa de Penicillium, obtendo a maior produção de enzimas quando utilizado o sulfato de amônio como fonte de nitrogênio, comprovando a eficiência deste composto para aplicação em meios fermentativos. O sulfato de manganês também apresentou um alto coeficiente, 4,0925 ±1,58 U.mL -1. Este fato pode ter ocorrido devido a enzima poder ser metalodependente deste íon ou mesmo a levedura necessitar deste íon para seu crescimento, devendo se realizar estudos mais aprofundados a fim de se elucidar o mecanismo gerado por esta substância. CONCLUSÃO Com os resultados obtidos é possível concluir que a cepa endofítica de Candida guilliermondi utilizada neste trabalho foi eficaz na produção de lipases, podendo ser considerada para a produção da enzima em larga escala para aplicações industriais, como por exemplo na síntese de biodiesel. O planejamento experimental aplicado neste trabalho demostrou o quanto esta ferramenta estatística pode ser útil na otimização de processos em curtos espaços de tempo, pois mesmo com um pequeno número de experimentos é capaz de gerar resultados satisfatórios e confiáveis. A utilização de resíduos pode ser uma boa opção na produção de metabolitos microbianos, como no caso das lipases deste trabalho, pois além de poder gerar resultados tão bons ou superiores aos de outras fontes de nutrientes também acabam acarretando um impacto positivo no ciclo produtivo da agroindústria, gerando valor também aos seu subprodutos. AGRADECIMENTOS Agradecemos ao CNPq pelo apoio financeiro ao projeto, a Capes pela concessão da bolsa de mestrado e a Universidade Tuiuti do Paraná por fornecer sua infraestrutura. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Champe, P. C; Harvey, R. A; Ferrier, D. R. Bioquímica ilustrada. 4. ed. Porto Alegre: Artmed, Contesini, F.J.; Lopes, D.B.; Macedo, G.A.; Nascimento, M.G.; Carvalho, P.O. Aspergillus sp. lipases: potencial biocatalyst for industrial use. Journal Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 67, p. 163, Couto, S.R.; Sanromán, M.A. Application of solid state fermentation to food industry A review. Journal of Food Engineering, v. 22, p. 211, Dalla-Vecchia, R; Nascimento, M.G.; Soldi, V. Aplicações sintéticas de lipases imobilizadas em polímeros. Química Nova. v. 27, p. 623, Damaso, M.C.T.; Passionoto, M.A.; Freitas, S.C.; Freire, D.M.G.; Lago, R.C.A.; Couri, S. Utilization of agroindustrial residues for lipase production by solid-state fermentation. Brazilian Journal Microbiology, v. 39, p. 676, Fernandes, M. L. M. Produção de lipases por fermentação no estado sólido e sua utilização em biocatálise. Setor de Ciências Exatas, Universidade Federal do Paraná, 2006 (Tese de Doutorado). Fernandes, M. L. M; Saad, E. B; Meira, J. A; Ramos, L. P; Mitchell, D. A; Krieger, N. Esterification and transesterification reactions catalysed by addition of fermented

8 26 Utilização de resíduos da agroindústria para a produção de enzimas lipolíticas por fermentação submersa Oliveira et al. solids to organic reaction media. Journal of Molecular Catalysis, v. 44, p. 8, Guimarães, T.M. Isolamento, identificação e seleção de cepas de levedura Saccharomyces cerevisiae para elaboração de vinho. Setor de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Paraná, 2005 (Dissertação de Mestrado). Ghori, M.I.; Iqbal, M.J.; Hamed, A. Characterization of a novel lipase from Bacillus sp. isolated from tannery wastes. Brazilian Journal of Microbiology, v. 42, p. 22, Hasan, F.; Shah, A.A.; Hameed, A. Industrial applications of microbial lipases. Enzyme Microbiology Technology, v. 39, p. 235, Iftikhar, T.; Niaz, M.; Zia, M.A.; Haq, I. Production of extracellular lipases by Rhizopus oligosporus in a stirred fermentor. Brazilian Journal of Microbiology, v. 41, p. 1124, Jaeger, K.E. and Reetz, M.T. Microbial lipases form versatile tools for biotechnology. Trends in Biotechnology, v.16, p , Kamini, N.R.; Fujii, T.; Iefuji, H. Production, purification and characterization of na extracelular lipase front eh yeast, Cryptococcus sp. S-2. Process Biochemistry, v. 36, p. 317, Li, N.; Zong, M.H. Lipases from the genus Penicillium: production, purification, characterization and applications. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 66, p. 43, Lima, V.M.G., Krieger, N., Sarquis, M.I.M., Mitchell, D.A., Ramos, L.P., Fontana, J.D. Effect of the nitrogen and carbon sources on lipase production by Penicillium aurantiogriseum. Food Technology and Biotechnology, v. 41, p. 105, Pandey, A.; Benjamin, S.; Soccol, C.R.; Nigam, P.; Krieger, N.; Thomaz Soccol, V. The realm microbial lipases in biotechnology. Biotechnology and Applied Biochemistry, v. 29, p. 119, 1999 a. Pandey, A., Selvakumar, P., Soccol, C.R.; Nigam, P. Solid state fermentation for the production of industrial enzymes. Current Science, v. 77, p. 149, 1999 b. Salihu, A.; Alam, M.Z.; Karim, M.I.A.; Salleh, H.M. Optimization of lipase production by Candida cylindracea in palm oil mil efluente based medium using statistical experimental design, Journal of Molecular Catalalysis. B: Enzymatic. 2011, 69, 66. Sharma, R.; Chisti, Y.; Banerjeea, U.C, Production, purification, characterization and applications of lipases. Biotechnology Advances, v. 19, p. 627, Silva, G.S.; Inoue, D.Y.; Dors, G.; Furigo Junior, A.; Castro, H.F. Desempenho de diferentes lipases imobilizadas na síntese de biodiesel de óleo de palma. Acta Scientiarum. Technology, v. 33, p. 197, 2011.