Produção e caracterização da quitosana extraída de Cunninghamella elegans

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1 Produção e caracterização da quitosana extraída de Cunninghamella elegans Nome dos autores: Kleydiane Braga Dias 1 ; Gessiel Newton Scheidt 2 1 Aluno do Curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia; Campus de Gurupi; kleydianedias@hotmail.com PIBIC/CNPq 2 Orientador do Curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia; Campus de Gurupi; gessielscheidt@yahoo.com.br RESUMO O polímero quitosana obtido da reação de desacetilação da quitina, que é encontrada na parede celular da maioria dos fungos apresenta-se como um grande potencial para diversas aplicações em virtude de características importantes. Entre os fungos que possuem este polissacarídeo destaca-se o fungo Cunninghamella elegans. Assim esse trabalho dedicou-se ao cultivo deste fungo em meio YPD partindo-se de cultura monospórica da amostra a partir de padronização de inóculo na concentração final de 106 esporos/ml em frascos erlenmeyers de 250mL contendo 50mL do meio. Durante o cultivo acompanhou-se o consumo de glicose, consumo de nitrogênio e determinou-se o ph no líquido metabólico, obtendo-se os resultados de peso de micélio de 0,26 g/100ml ou 2,6 g/l. Os resultados obtidos para consumo de glicose foram mostram uma curva decrescente; em relação ao consumo de nitrogênio, verifica-se um decréscimo na quantidade de nitrogênio nas primeiras 12 horas e entre 36 e 60 horas; e o ph do meio oscilou entre 4 e 7, atingindo seu valor mais baixo nas primeiras 12 horas, e atingindo os seus valores mais altos (próximos a 7) ao final do tempo de cultivo. Palavras-chave: Fungo; Cunninghamella elegans; YPD; Quitosana. INTRODUÇÃO A quitina é o segundo polímero mais abundante na natureza, perdendo somente para a celulose, e sua constituição baseia-se em uma sequencia linear de açúcares monoméricos (DALLAN, 2005). Tem distribuição vasta na natureza, podendo ser encontrada na cutícula de insetos e na parede celular de fungos, e no exoesqueleto de

2 crustáceos (FAI et al., 2008). A partir da reação de desacetilação da quitina obtém-se a quitosana. Essa reação consiste na transformação dos grupos acetoamido (-NHCOCH3) da quitina em grupos amino (-NH2). A quitosana é semelhante quimicamente com a quitina diferindo no carbono 2, onde a quitosana possui uma amina primária (-NH2) (ASSIS et al., 2005). A quitosana possui características importantes como biocompatibilidade, biodegradabilidade e propriedades antimicrobianas (ASSIS et al., 2005), bem como insolubilidade em água, álcool, acetona e solubilidade em soluções de ácidos orgânicos com ph menor que seis (DALLAN, 2005). Desse modo, algumas das inúmeras aplicações são remoção de metais pesados (FRANCO, 2004), tratamento de efluentes (OLIVEIRA, 2006), atividade conservante (FAI et al., 2008), aplicações farmacêuticas (TORRES et al., 2009) atividade antioxidante (MARICATO, 2010) e atividade antitumoral (MEDEIROS, 2011). A extração de quitina a partir da parede celular de fungos torna-se vantajosa por apresentar extração tanto de quitina como de quitosana, produção em larga escala e independer de fatores sazonais (FAI et al., 2008). Estudos demonstram várias espécies de fungos que podem ser utilizadas como fontes para produção de quitina e quitosana, destacando-se o grupo pertencente à Ordem Mucorales, classe Zygomycetes, pelo conteúdo significativo desses polissacarídeos na estrutura das paredes celulares (SILVA, 2007). Pode-se citar, por exemplo, estudos com Rhizopus arrhizus (SILVA, 2007) e Cunninghamella elegans (FRANCO, 2004). Desse modo, o fungo Cunninghamella elegans possui grande potencial para produção de quitina e quitosana, em virtude de possuir grande quantidade destes polímeros em sua parede celular, sendo grande objeto de estudo, como se percebe nos trabalhos de Stamford et al. (2007) e Franco et al. (2005). MATERIAL E MÉTODOS O cultivo do microrganismo foi feito utilizando cepa de Cunninghamella elegans. Para manutenção da amostra utilizou-se o meio YPD (Extrato de levedura

3 Peptona Dextrose) e para o cultivo em batelada utilizou-se 50 ml do meio YPD, o qual é composto por 20 g/l de glicose, 10 g/l de extrato de levedura e 20 g/l de peptona. A padronização de inóculo foi feita partindo-se de cultura monospórica da amostra através de contagem de esporos em hematocitômetro na concentração final de 106 esporos/ml em frascos erlenmeyers de 250mL contendo 50mL do meio descrito para cultivo em batelada. Em seguida, efetuou-se incubação a 28 C durante 96 horas, sob agitação orbital de 100 rpm. Alíquotas foram retiradas a cada 12 horas e filtradas em membrana de nylon, e a biomassa submetida ao processo de liofilização para acompanhamento do crescimento e extração de quitina e quitosana. Durante o cultivo acompanhou-se o consumo de glicose, consumo de nitrogênio e determinou-se o ph no líquido metabólico. O consumo de glicose foi determinado utilizando o método enzimático colorimétrico (LabTest ), sendo realizada uma curva padrão com solução de glicose (0,5-5,0g/mL), tendo as leituras sido efetuadas em espectrofotômetro digital. Para a determinação de proteínas totais utilizou-se o método colorimétrico (LabTest ), com solução padrão BSA (albumina de soro bovino) variando a faixa de concentração entre 1,0 e 4,0g/dl. A absorbância para leitura foi de 545nm.E a determinação do ph foi realizada por potenciometria, utilizando-se potenciômetro digital. RESULTADOS E DISCUSSÃO A partir do cultivo em batelada em duplicata e incubação em tempo estabelecido efetuou-se a retirada dos erlenmeyers da mesa agitadora, filtragem dos quatro meios e posterior pesagem da massa micelial obtida dos quatro erlenmeyers, resultando em um peso de micélio de 0,26 g/100ml ou 2,6 g/l. O resultado obtido não foi o esperado, até porque foi um resultado demasiadamente baixo. Comparando esse resultado com outros descritos na literatura, percebe-se a discrepância de valores, como nos trabalhos de Carvalho (2000) com 13 g/l e de Andrade et al. (2000) com 11 g/l de peso micelial. Outro trabalho, o de Franco et al. (2005) demonstra um rendimento em biomassa de 11,6 g/l; isso mostra o grande potencial deste fungo para extração do polímero quitosana, mas também evidencia a

4 necessidade de mais estudos e repetições na metodologia deste trabalho para se descobrir os erros cometidos e repará-los a fim de se chegar a resultados satisfatórios. Em relação a determinações de consumo de glicose tem-se que o cálculo da concentração de glicose no meio líquido demonstra uma curva decrescente, o que caracteriza um consumo constante de glicose. Em relação ao consumo de nitrogênio verifica-se um decréscimo na quantidade de nitrogênio nas primeiras 12 horas e entre 36 e 60 horas caracterizando o consumo dos substratos pelo microrganismo. Entre 12 e 36 horas e 60 a 96 horas de cultivo observou-se um aumento na quantidade de proteínas totais que pode ser devido à produção de enzimas pelo fungo, tais como quitinase e devido à produção de compostos nitrogenados originados a partir do metabolismo secundário do fungo ao final de seu crescimento. O ph do meio oscilou entre 4 e 7. Nas primeiras 12 horas, o ph atingiu o seu valor mais baixo (fase exponencial) devido a troca metabólica com o substrato do meio e formação de ácido pirúvico. Contudo, após a fase lag em que apresenta valores aproximadamente constantes (entre 5 e 6) o ph tende à neutralidade, atingindo os seus valores mais altos (próximos a 7) possivelmente por causa das baixas concentrações de glicose no meio ao final do tempo de cultivo. Os parâmetros de consumo de glicose, consumo de nitrogênio e ph assemelham-se aos encontrados na literatura, como se percebe no trabalho de Franco et al. (2005), já anteriormente citado e o trabalho de Félix et al. (2009) utilizando meio Sabouraud. Desse modo, apesar do rendimento em biomassa não ter apresentado resultados satisfatórios e semelhantes à literatura, os demais parâmetros avaliados equiparam-se aos trabalhos tomados como base. LITERATURA CITADA ANDRADE, V.S. et al. A factorial design analysis of chitin production by Cunninghamella elegans. Can. J. Microbiol., 46: , 2000 ASSIS, A. S. et al. Bioconversão de resíduos de camarão Litopenaeus vannamei (Booner, 1931) para produção de biofilme de quitosana. Biofilme de quitosana. Revista Iberoamericana de Polímero-- Volume 9(5), Outubro de CARVALHO, R. C. G. Produção de quitina por Cunninghamella elegans e sua aplicação na reabilitação de lesões experimentais. Tese de Mestrado, 2000.

5 DALLAN, P. R. M. Síntese e caracterização de membranas de quitosana para aplicação na regeneração de pele. Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química.--Campinas, SP: [s.n.], FAI, A. E. C. et al. Potencial biotecnológico de quitosana em sistemas de conservação de alimentos. Quitosanos em alimentação. Revista Iberoamericana de Polímero-- Volume 9(5), Julho de FÉLIX, F. F. et al. Perfil de crescimento de Cunningamella elegans (UCP 542) em meio Sabouraud. Programa de Pós Graduação em Ciências do Solo, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Dissertação, FRANCO, L. O. et al. Cunningamella elegans (IFM 46109) como fonte de quitina e quitosana. Artigo. Revista Analytica-- Nº14. Dezembro/Janeiro, MARICATO, E. S. O. Desenvolvimento de filmes de quitosana insolúveis em meio ácido com actividade antioxidante. Dissertação de Mestrado em Bioquímica. Departamento de Química. Universidade de Aveiro MEDEIROS, K. A. de. Desenvolvimento e testes in vitro de nanopartículas de quitosana para liberação controlada de peptídeos antitumorais. Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Dissertação (Mestrado). Pós-graduação em Biologia Animal. Universidade de Brasília. Brasília, Fevereiro de OLIVEIRA, J. L. de. Fotodegradação de corantes têxteis e aplicação da quitosana como tratamento terciário destes efluentes. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós- Graduação em Química. Departamento de Química -- Centro de Ciências Exatas. Universidade Estadual de Maringá. Maringá, SILVA, A. C. da. Produção de quitina e quitosana em culturas submersas de Rhizopus arrhizus nos meios milhocina e sintético para Mucorales. Dissertação (Mestrado) Universidade Católica de Pernambuco. 97f Recife, STAMFORD, T. C. M. et al. Growth of Cunninghamella elegans UCP 542 and production of chitin and chitosan using yam bean medium. Electronic Journal of Biotechnology ISSN: Vol.10 N 1. Pontificia Universidad Católica de Valparaíso Chile, Janeiro de TORRES, A. A. F. N. et al. Microesferas de quitosana para utilização como sistemas de liberação controlada de fitoterápicos. IV CONNEPI - Congresso de Pesquisa e Inovação da Rede Norte e Nordeste de Educação Tecnológica. Belém-PA, AGRADECIMENTOS "O presente trabalho foi realizado com o apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CNPq Brasil"