Cinética de Processos Fermentativos

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1 Disciplina Biotecnologia Farmacêutica FFM 426 Departamento de Biotecnologia Farmacêutica Faculdade de Farmácia/ CCS-UFRJ Cinética de Processos Fermentativos Profa Dra. Evelin Andrade Manoel 2017/1

2 1) Definição O que é cinética de processos fermentativos? O estudo cinético de um processo fermentativo consiste na análise da evolução dos valores de concentração de um ou mais componentes do sistema de cultivo em função do tempo de fermentação Microrganismo Meio de cultivo Desaparecimento de Biomoléculas substrato Biomassa Biomassa produzida Metabolitos primários e secundários: álcool, ácido cítrico etc. Produto formado

3 Quais os principais objetivos da cinética de um Bioprocesso? Medir taxas de transformações; Estudar a influência de fatores nessas taxas; Correlacionar, por meio de equações empíricas ou modelos matemáticos, as taxas de transformações com os fatores que nelas influenciam; Aplicar as equações obtidas na otimização e no controle do bioprocesso. Os conhecimentos dos parâmetros cinéticos auxiliam todo o processo microbiano, por ex.: realizar a transposição de um experimento de laboratório para escala industrial!!!!

4 2) Estudo cinético: Taxas específicas de crescimento (µ), de formação de produto (qp) e de consumo de substrato (qs) Curva a partir dos pontos experimentais... Considerando um processo descontínuo Neste caso, admitimos que: X= concentração celular P=concentração de produto S= concentração de substrato

5 2) Estudo cinético de processos fermentativos Taxas específicas de crescimento (µ) Valor de X em um determinado instante x Velocidade instantânea Δx/Δt = (X-Xo)/(tf-ti) Velocidade específica de formação de biomassa Concentração microbiana aumenta (X) durante o processo fermentativo, logo naturalmente está contribuindo para formação de S em P. Neste caso, admitimos que: Xo= concentração inicial celular X= concentração final celular

6 2) Estudo cinético de processos fermentativos Taxas específicas de crescimento (µ) Valor de X em um determinado instante qp = p Δp/Δt = (P-Po)/(tf-ti) Velocidade específica de formação de produto Neste caso, admitimos que: Po=concentração inicial de produto P=concentração final de produto

7 2) Estudo cinético de processos fermentativos Taxas específicas de crescimento (µ) Valor de X em um determinado instante qs = s Velocidade específica de consumo de substrato Neste caso, admitimos que: So= concentração inicial de substrato S=concentração final de substrato

8 3) Fatores de conversão e Produtividade Considerando um determinado tempo (t) do processo de fermentação, os valores de X, S e P poderão ser relacionados entre si, através de fatores de conversão e produtividade

9 Aula 3 - Cinética de Processos Fermentativos

10 3) Definição dos Fatores de Rendimento para o Crescimento e a Formação de Produto e suas Relações com as Taxas Específicas Massa de células formadas Massa de substrato consumido Fator de conversão substratos em células Por que realizar estas conversões? Qual a importância destes fatores de conversão para o bioprocesso?

11 3) Definição dos Fatores de Rendimento para o Crescimento e a Formação de Produto e suas Relações com as Taxas Específicas Massa de produto obtido Massa de substrato consumido Fator de conversão substrato em produto Por que realizar estas conversões? Qual a importância destes fatores de conversão para o bioprocesso?

12 3) Definição dos Fatores de Rendimento para o Crescimento e a Formação de Produto e suas Relações com as Taxas Específicas Massa de produto obtido Massa de células formadas Fator de conversão célula em produto Por que realizar estas conversões? Qual a importância destes fatores de conversão para o bioprocesso?

13 4) Crescimento microbiano Aula 3 - Cinética de Processos Fermentativos

14 4) Crescimento microbiano Fase Lag Não há aumento no número de células; Síntese de enzimas indutivas para a utilização do substrato/outros nutrientes; É importante reduzir o período da fase lag para aumentar produtividade, o que pode ser conseguido pela adoção de diferentes estratégias: Quanto tempo pode durar a fase Lag? O que fazer para diminuir este tempo? Como a preparação do inóculo pode influenciar esta fase? i. Inocular o meio com células na fase exponencial do crescimento; ii. Pré-aclimatar o inóculo no meio de cultivo; iii. Usar altas concentrações de inóculo (5-10% por volume)

15 4) Crescimento microbiano Fase Exponencial As concentrações de substrato e nutrientes são altas; O número e a concentração de células aumentam exponencialmente a uma taxa constante (crescimento balanceado); A taxa de crescimento é independente da concentração de substrato e de nutriente. O crescimento não se encontra limitado; Crescimento é balanceado composição celular constante.

16 4) Crescimento microbiano Fase Exponencial Velocidade específica de crescimento é constante e máxima µx = µmax = constante E ainda: Então: Integrando... rearranjando... Velocidade de crescimento é diretamente proporcional a concentração celular!!!

17 4) Crescimento microbiano Fase Exponencial Velocidade específica de crescimento é constante e máxima µx = µmax = constante

18 4) Crescimento microbiano Fase Exponencial É ainda nesta fase que se calcula o tempo de duplicação celular (td) X2 = 2X1 t2-t1=td td inversamente proporcional a taxa específica de crescimento!!!

19 4) Crescimento microbiano Diferença entre crescimento e multiplicação celular CRESCIMENTO: aumento ordenado de todos os constituintes de uma célula (efetua-se a todo momento). Está relacionado ao aumento da MASSA CELULAR. MULTIPLICAÇÃO só se apresenta no instante da divisão celular. Está relacionada ao aumento do NÚMERO DE CÉLULAS. No entanto, como a probabilidade de existirem células se multiplicando a todo instante é muito grande, considerar-se-á o crescimento como o aumento do material celular, expresso em termos de massa ou número de células.

20 4) Crescimento microbiano O tempo de duplicação celular (td) varia de microrganismo para microrganismo...

21 4) Crescimento microbiano O tempo de duplicação celular (td) varia de micro-organismo para micro-organismo... Valores do tempo de duplicação e de μ dependem de: - potencial genético da estirpe microbiana. - composição do meio de cultura; - condições ambientais (Temperatura, ph, disponibilidade de água, nível de oxigénio, etc.)

22 4) Crescimento microbiano Fase de desaceleração Redução de velocidade Porque ocorre a redução de velocidade de crescimento??? Esgotamento de um ou mais nutrientes; Acúmulo de substâncias (subprodutos) tóxicas ao crescimento; O crescimento deixa de ser balanceado e o metabolismo muda da plasticidade para sobrevivência celular.

23 Fase estacionária Não há aumento no número ou na concentração celular. Não há crescimento líquido ; Taxa de crescimento celular = taxa de morte celular; Metabólitos (produtos) secundários são produzidos; Metabolismo endógeno resultante do armazenamento de energia pode resultar em manutenção da viabilidade celular; Células podem se aclimatar e consumir (remover) compostos inibidores que resultarão em crescimento adicional posterior a esta fase (diauxia).

24 Fase de declínio ou morte Ocorre lise celular; Crescimento pode ser retomado pela transferência das células para meio novo.

25 O QUE PODE INFLUENCIAR O µ?

26 Influência da Temperatura sobre µ Por ser um sistema multi-enzimático, as reações individuais que ocorrem dentro da célula são influenciadas pela temperatura, analogamente ao que ocorre na cinética da ação enzimática, sendo esta dependência representada pela equação de Arrhenius.

27 Influência da concentração de S sobre µ A relação entre a concetração de substrato (S) limitante no meio com a velocidade específica (µ) tem sido comumente empregada pela equação empírica proposta por Monod. Similar a equação proposta por Michaelis-Menten

28 Influência da concentração de S sobre µ Determinação dos parâmetros cinéticos Ks e µmax

29 Influência da concentração de S sobre µ Determinação dos parâmetros cinéticos Ks e µmax

30 5) CINÉTICA DOS PROCESSOS Classificação Cinética de Gaden 1. Produção associada ao crescimento 2. Produção semi-associada ao crescimento 3. Produção não-associada ao crescimento

31 5) CINÉTICA DOS PROCESSOS Aula 3 - Cinética de Processos Fermentativos Exemplo de cinética de produção associada ao crescimento celular Produção de etanol por Zymomonas mobilis. Fonte: Rogers et al. (1980) Produção de gramicidina por Bacillus brevis. Fonte: Kosaric et al. (1993)

32 5) CINÉTICA DOS PROCESSOS Exemplo de cinética de produção semi-associada ao crescimento celular

33 5) CINÉTICA DOS PROCESSOS Exemplo de cinética de produção não associada ao crescimento celular Produção de raminolipídeos por Pseudomonas aeruginosa Fonte: Venkata et al. (1990)

34 Conclusão Agora já é possível responder algumas perguntas... Qual a importância do estudo cinético para o controle do processo fermentativo? No que ele auxilia?? O que se espera com os resultados cinéticos?

35 Métodos para a medida do crescimento microbiano

36 Métodos para a medida do crescimento microbiano Para um estudo quantitativo da cinética de processos fermentativos é necessário dispor de métodos experimentais sensíveis para determinar o crescimento das populações microbianas. Faz-se necessário considerar neste processo o modo de reprodução das células procarióticas e eucarióticas Este processo pode ser conduzido por Métodos diretos ou Métodos indiretos

37 Métodos para a medida do crescimento microbiano Métodos diretos: Contagem -ao microscópio -por plaqueamento Massa seca Absorvância Volume de centrifugado Métodos indiretos: Proteína DNA ATP CO2 Calor evolvido Consumo de oxigênio ou de outros nutrientes Radioatividade incorporada

38 Métodos para a medida do crescimento microbiano Métodos diretos: Contagem Observação microscópica de esporos de fungos filamentosos H. grisea (a) e T. reesei (b) com aumento de 400x, para contagem de esporos

39 Métodos para a medida do crescimento microbiano Métodos diretos: Contagem Contagem em Câmara de Neubauer

40 Métodos para a medida do crescimento microbiano Contagem por plaqueamento

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42 Métodos para a medida do crescimento microbiano Métodos diretos: Contagem Massa seca Absorvância Volume de centrifugado Métodos indiretos: Proteína DNA ATP CO2 Calor evolvido Consumo de oxigênio ou de outros nutrientes Radioatividade incorporada

43 Massa seca Separação de células por filtração

44 Métodos para a medida do crescimento microbiano Métodos diretos: Contagem Massa seca Absorvância Volume de centrifugado Métodos indiretos: Proteína DNA ATP CO2 Calor evolvido Consumo de oxigênio ou de outros nutrientes Radioatividade incorporada

45 Métodos para a medida do crescimento microbiano Métodos diretos: Absorvância

46 Métodos para a medida do crescimento microbiano Métodos diretos: Contagem Massa seca Absorvância Volume de centrifugado Métodos indiretos: Proteína DNA ATP CO2 Calor evolvido Consumo de oxigênio ou de outros nutrientes Radioatividade incorporada

47 Métodos para a medida do crescimento microbiano Métodos indiretos

48 Métodos para a medida do crescimento microbiano Métodos indiretos Luciferina: ácido 4,5-dihidro-2-(6,hidroxi-2-benzotiazolil)-4,tiazolecarboxilíco Sensibilidade do método: 10-9 mg ATP/L

49 Métodos para a medida do crescimento microbiano Métodos indiretos CO2 Correlação entre a produção de CO2 e a concentração celular no crescimento de Penicillium chrysogenum Crescimento de Escherichia coli e Produção de CO2 nos gases de saída durante uma cultura em batelada

50 Conclusão Agora já é possível responder algumas perguntas... Qual a importância do estudo cinético para o controle do processo fermentativo? No que ele auxilia?? O que se espera com os resultados cinéticos?

51 Tarefa para a próxima aula Em uma fermentação batelada a volume constante foram obtidos os seguintes dados experimentais: T(h) X(g/L) Pede-se: a) Construa o gráfico e identifique as diversas fases de crescimento do microrganismo. b) Qual o tempo que o microrganismo leva para duplicar a sua massa na fase exponencial de crescimento? c) Qual a produtividade máxima em células que pode ser obtida desse processo?