CATÁLISE ENZIMÁTICA. CINÉTICA Controle da velocidade de reações. CINÉTICA Equilíbrio e Estado Estacionário

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1 CATÁLISE ENZIMÁTICA Equilíbrio e Estado Estacionário P U T F M A Velocidade: período inicial Tempo As medidas de velocidade inicial (v 0 ) são obtidas com a variação da concentração de S btenção de várias medidas de v 0 para a construção de um gráfico eterminação da inclinação (tangente) A análise gráfica leva a determinação de vários parâmetros cinéticos P U T F M A

2 P U T F M A Velocidade: período inicial Tempo Vo refere-se a quantidade de produto formado na unidade de tempo ensaio envolve a adição de todos os componentes, incluindo S e E Após a adição da E, a absorbância (Abs) é monitorada em função do tempo Abs vs tempo pode ser monitorada e a inclinação determinada Inclinação = Abs/unidade de tempo (min) Lembrar: A = cl (mudança [P]) [S] Tempo eterminação da velocidade inicial de uma reação catalisada por enzima a partir da inclinação instantânea em t = 0 no consumo de substrato ou formação do produto [P] Tempo Considerações Importantes: A enzima deve permanecer estável no curso de tempo de todas as medidas cinéticas As taxas iniciais são usadas como medidas de velocidades de reação A velocidade de reação não pode ser dependente da concentração de enzima Gráfico da conversão de S em P, na reação catalisada por uma enzima A produção de produto é linear com o tempo durante o tempo de intervalo usado

3 Constantes Cinéticas A concentração de substrato excede em muitas vezes a concentração de enzima, ou seja, a concentração de S é praticamente constante durante o ensaio K M k cat Uma única enzima é capaz de formar um produto Não existe produção considerável de produto na ausência de enzima Não existe cooperatividade. A ligação do substrato ao sítio de ligação na enzima não influencia a afinidade ou atividade de um sítio adjacente v 0 MEIAS S k cat /K M Nem substrato nem produto atuam como moduladores alostéricos ou alteram a velocidade de reação enzimática ½V max Constantes Cinéticas Constantes Cinéticas K M ÉaconstantedeMichaelis-Menten,queserefereàconcentração de substrato necessária para atingir a metade da V max na reação enzimática, em condições de saturação de S. K M representa a concentração de S na qual metade dos sítios ativos da enzima encontra-se saturado por moléculas de S, no estado estacionário. K M é uma constante de dissociação aparente e está relacionada com a afinidade da enzima pelo S, sendo o produto de todas as constantes de equilíbrio e dissociação até a etapa irreversível da reação. Quanto menor o valor de K M,maiorseráa afinidade da enzima pelo S. valor de K M varia consideravelmente de uma enzima para outra, e de uma enzima em particular, para S diferentes. Seu valor é expresso em concentração molar (e.g., M, mm, µm). k cat É uma constante de velocidade de primeira ordem que corresponde à etapa mais lenta da reação catalítica. valor de k cat é referido como o número de ciclos ou renovação (termo do inglês, turnover number), que corresponde ao número máximo de mols de S convertidos em P por mols de enzima por unidade de tempo (e.g., define o número de ciclos catalíticos que ocorre por unidade de tempo). Esta condição é encontrada somente quando a enzima está saturada pelo S. valordev max éexpressoemconcentraçãomolardesouppor unidade de tempo (e.g., M/min, µm/min), ao passo que k cat em tempo (e.g., min -1,s -1 ).

4 Constantes Cinéticas Parâmetros Cinéticos k cat /K M Essa razão define a eficiência catalítica de uma enzima e possui unidades de velocidade de segunda ordem. É bastante utilizada para avaliar a eficiência de diferentes enzimas, bem como para comparar o emprego de diferentes S para uma enzima em particular. A especificidade do S resulta preferencialmente de diferenças no estado de transição da reação catalisada em comparação as interações de ligação do estado fundamental. A razão k cat /K M reflete os efeitos de S nas duas constantes cinéticas e fornece um limite menor para a constante de velocidade de segunda-ordem e ligação do S. Medida ireta da eficiência da enzima na transformação do substrato K cat /K M : Eficácia na transformação do substrato ligado Eficiência na ligação do substrato V max v 0 K M UNIAES µm s -1 k cat /K M µm s -1 µm k cat s -1 µm -1 s -1 A velocidade de uma reação enzimática depende da concentração de enzima Podemos observar este efeito através de um gráfico das curvas de formação de P na presença de concentrações crescentes de enzima (onde a concentração de S é mantida constante) Formação de P em função de concentrações crescentes de enzima

5 Verifica-se que v o cresce linearmente com a concentração de enzima em condições padrões de reação. (no intervalo de [E] = 8 [E 1 ]) efeito da variação da concentração de S na velocidade de reação também é um fator importante a ser considerado no controle de reações enzimáticas. Podemos observar este efeito através de um gráfico das curvas de progresso de formação de P em função de concentrações crescentes de S, onde a concentração de enzima é mantida constante. Efeito da concentração de enzima na velocidade inicial de reação catalisada por enzima Avariaçãodev 0 em função da concentração de S é mostrada na Figura, cuja representação característica é de uma hipérbole. Cada medida de v 0 é determinada experimentalmente através das inclinações dos gráficos de concentração de P em função do tempo. Podem ser identificadas três regiões distintas na curva de progresso de reação. Na primeira região, em concentrações muito baixas de S ([S] < 0,01 K M ), a velocidade apresenta um perfil cinético de primeira ordem. Com o aumento na concentração de S, em uma região intermediária do gráfico, a velocidade apresenta uma dependência curvilínea em relação à concentração de S. Naterceiraregião do gráfico, observa-se a ocorrência de um patamar máximo caracterizado por altas concentrações de S, com perfil cinético de ordem zero, no qual v 0 é independente da concentração de S. Neste ponto, a enzima encontra-se saturada pelo S, e v 0 torna-se igual à velocidade máxima (V max ). Formação de P em função de concentrações crescentes de substrato Efeito da concentração de S na velocidade inicial de reação catalisada por enzima

6 Em 1913, Leonor Michaelis e Maud Menten demonstraram que as reações enzimáticas ocorrem em duas etapas. Na primeira etapa, ocorre a formação de um complexo E S, ao passo que, em uma segunda etapa, observa-se a dissociação deste complexo para a formação de P e a liberação da enzima livre. Este modelo assume que as reações cinéticas são conduzidas sob condições experimentais do chamado estado estacionário (do inglês, steady-state), que se refere ao intervalo de tempo no qual o complexo E S é mantido em um nível constante elevado. Em outras palavras, o equilíbrio entre enzima, S, e E S é estabelecido de forma muito rápida em relação à reação subsequente sofrida pela espécie de E S. Assim, ocomplexoe S estará em equilíbrio com a enzima e S, o que significa que k 1 >> k -1 e k 2. epresentação gráfica do equilíbrio rápido entre enzima, S, e E S, no estado estacionário (a corresponde ao período de indução e b a v o ). As análises cinéticas no estado estacionário permitem uma interpretação conveniente do curso de reações enzimáticas, sendo alcançada no laboratório em condições experimentais apropriadas, mantendo-se a concentração de S em grande excesso em relação à concentração de enzima ([S] >> [E 0 ]). esta forma, a enzima está presente em quantidades catalíticas e a variação da concentração de S (consumo) pode ser considerada desprezível. gráfico da figura anterior mostra que as inclinações das curvas de progresso de enzima e E S podem ser consideradas desprezíveis (com exceção de um breve período de indução da ordemdemilésimosdesegundo). A equação abaixo apresenta uma descrição quantitativa do esquema de Michaelis- Menten sob condições do estado estacionário, que pode ser caracterizada graficamente por uma curva de reação na forma de uma hipérbole. Isso indica que estas espécies podem ser consideradas constantes na unidade de tempo (sendo [S] >> [E] T,onde[E] T é a concentração total de enzima). Equação de Michaelis-Menten para a velocidade de reação catalisada por uma enzima.

7 Embora a interpretação deste gráfico seja relativamente simples, existem tratamentos matemáticos e gráficos que permitem a obtenção rápida dos parâmetros cinéticos. método tradicional baseia-se na representação linear da equação de Michaelis-Menten através de uma reta do tipo y = ax + b Velocidade (nm min -1 ) egião de ordem zero egião de primeira ordem eterminação experimental de K M e V max na cinética de Michaelis-Menten Gráfico da velocidade inicial versus concentração de substrato para uma reação catalisada por uma enzima. egiões de reação de primeira ordem e de ordem zero apresentam dependência linear e independência da concentração de substrato, respectivamente ecíproco da equação de Michaelis-Menten Este gráfico, chamado de Lineweaver-Burk ou de duplo-recíproco (i.e., uma representação gráfica dos recíprocos de v o e [S]), permite a determinação simples e direta de V max e K M, parametros que só poderiam ser estimados por aproximação a partir do gráfico de Michaelis-Menten. valor de k cat, por sua vez, pode ser obtido dividindo-se V max pela concentração de enzima empregada nos experimentos (k cat = V max /[E]). Este tratamento dá origem a um gráfico de 1/v o (em y) emfunçãode1/[s](emx) com uma reta de inclinação igual a K M /V max, que intercepta o eixo de ordenadas no ponto 1/V max e o eixo das abcissas no ponto -1/K M

8 Este gráfico, chamado de Lineweaver-Burk ou de duplorecíproco (i.e., uma representação gráfica dos recíprocos de v o e [S] de acordo com a equação anterior), permite a determinação simples e direta de V max e K M, parâmetros que só poderiam ser estimados por aproximação a partir do gráfico de Michaelis-Menten. valor de k cat, por sua vez, pode ser obtido dividindo-se V max pela concentração de enzima empregada nos experimentos. k cat = V max /[E T ]