Enzimas. Bianca Zingales IQ - USP

Transcrição

1 Enzimas Bianca Zingales IQ - USP

2 Enzimas As enzimas são catalisadores biológicos extremamente eficientes que aceleram 10 9 a vezes (em média) a velocidade da reação. As enzimas chegam a transformar de 100 a 1000 moléculas de substrato em produto por minuto de reação. A maior parte das Enzimas são PROTEÍNAS (ou Glicoproteínas) Existem algumas ribonucleoproteínas (RIBOZIMAS) com atividade enzimática. Nas ribozimas a atividade catalítica está na porção do RNA (ver Módulo de Bio Mol).

3 Catalisadores e Velocidade das Reações Químicas Catalisadores aumentam a velocidade da reação Catalisadores não são consumidos durante a reação Uma quantidade muito pequena de catalisador é capaz de afetar a velocidade da reação de uma quantidade muito grande de reagente. Os catalisadores não mudam a constante de equilíbrio da reação. Todas estas propriedades são válidas para as Enzimas

4 Sítio Ativo O sítio ativo é a região da enzima onde se liga o substrato e ocorre a catálise. O sítio ativo é determinado pela estrutura terciária da proteína Na figura, uma molécula de carboidrato está ligada ao sítio ativo da enzima lisozima.

5 Dois modelos para o Sítio Ativo 1. Modelo Chave-Fechadura Sítio ativo é complementar à estrutura do substrato

6 2. Modelo Encaixe Induzido O substrato é distorcido ao ligar-se ao sítio ativo, favorecendo a catálise

7 No sítio ativo ficam expostas as cadeias R dos aminoácidos. Substrato Grupos R dos aminoácidos Alguns grupos R interagem com o Substrato. Destes, uns grupos R servem para ligar o Substrato; outros atuam na catálise

8 Como ocorre a catálise? A catálise enzimática é promovida pelas interações entre o grupo R de certos aminoácidos do sítio ativo da Enzima e regiões do substrato. Substrato

9 Resíduos para ligação do substrato A ligação é estabilizada por muitas interações fracas entre o grupo R de certos resíduos de aminoácidos da Enzima e regiões do substrato : - pontes de hidrogênio - interações eletrostáticas - forças de van der Waals - contatos hidrofóbicos

10 Resíduos para a catálise EX: Lisozima hidrolisa o Polissacarídio da parede bacteriana

11 Ex. Participação do Glutamato 35 e Aspartato 52 da Lisozima na quebra da ligação glicosídica

12 Enzima e Substrato formam um complexo transitório, denominado ES Etapas: k1 E + S ES E + P k2 k3 Durante a reação enzimática, uma fração da enzima E está ligada ao Durante a reação enzimática, uma fração da enzima E está ligada ao Substrato e outra fração está livre.

13 Reação com dois Substratos originando dois Produtos k1 E + A + B E-AB E + C + D k2 k3 E E E E

14 Velocidade da Reação Enzimática é diretamente proporcional à concentração da Enzima E + S [ES] V = d[p] dt P P Notar que: 1. A concentração de Substrato é a MESMA nas duas situações 2. Dobrou a quantidade de enzima

15 Representação da velocidade da reação em função da concentração da Enzima V Velocidade é geralmente expressa em quantidade de produto formado por minuto (Ex: µg de Produto/min ). v = d [P] / dt [E] Quando a concentração de substrato não é limitante, a velocidade da reação é diretamente proporcional à concentração da Enzima

16 Variação da velocidade da reação em função da concentração do Substrato Vmax V V [S] A velocidade da reação é proporcional à quantidade de Enzima ligada ao Substrato [ES]

17 Aumentando a concentração da Enzima aumenta a velocidade da reação V1

18 Michaelis & Menten Pais da cinética enzimática

19 K M Constante de Michaelis K M é numericamente igual à concentração de Substrato que determina a metade da velocidade máxima da reação A unidade de K M é concentração

20 K M Independe da concentração da Enzima

21 K M O valor de K M é característico da enzima e de seu substrato O valor de K M indica o grau de afinidade da enzima pelo Substrato (quanto menor K M, maior é a afinidade) Isto porque com MENOR concentração de substrato atinge-se metade da velocidade máxima Vmax E1 Vmax 2 Vmax E2 Vmax 2 K M 1 K M 2 [S] K M 1 < K M 2

22 Valores de K M Enzima K M (mm) Catalase 25 Hexoquinase 0,4 Anidrase Carbônica 0,05 Quimotripsina 108 Beta-galactosidase 4

23 Variação da Velocidade de Reação em função do ph Causas Variação do estado de ionização dos grupos R envolvidos na catálise Variação do estado de ionização do Substrato Variação da estrutura de proteína (principalmente nos extremos de ph) A protonação ou desprotonação dos resíduos de aminoácidos em função do ph altera a eficiência da ligação da Enzima ao Substrato e a eficiência da catálise

24 ph ótimo de enzimas Para muitas enzimas, o ph ótimo está próximo a ph 7 Para outras, é diferente: Enzima ph Pepsina 1,5 Fosfatase ácida 4,5 Urease 6,5 Tripsina 7,8 Arginase 9,7

25 Cofatores de enzimas Cofatores são moléculas ou íons ( ex Mg 2+ ) imprescindíveis para a atividade de inúmeras enzimas. Alguns cofatores são também chamados de Coenzimas (NAD, CoA, TPP). O C O O C O NADH NAD + H C OH NADH C O C H 3 C H 3 O H C C O OH E O C O + NAD + C O + NADH C H 3 Lactato C H 3 Piruvato

26 Inibidores Enzimáticos Substâncias que diminuem a atividade enzimática Os inibidores podem ser IRREVERSÍVEIS ou de REVERSÍVEIS Inibidores IRREVERSÍVEIS Ligam-se às enzimas com alta afinidade. Muitas vezes de forma covalente. Venenos

27 Inibidores IRREVERSÍVEIS e Medicamentos Aspirina inibe a Ciclooxigenase (COX 1) responsável por processos inflamatórios Inativando a enzima, o processo inflamatório diminui ou desaparece.

28 Inibidores REVERSÍVEIS Ligação entre a enzima e o inibidor não é covalente. Papel importante no controle do Metabolismo. Os inibidores estabelecem um equilíbrio com o substrato Tipos de Inibição Competitiva e Não Competitiva

29 Inibição Competitiva Inibidor compete com o Substrato pelo sítio ativo E + S ES E+ P Substrato e Inibidor têm estrutura semelhante

30 O aumento da concentração de substrato, desloca o inibidor V max conservado KM aumenta Software

31 Inibição Não Competitiva P Inibidor liga-se fora do sítio ativo e altera a estrutura do sítio ativo, dificultando a entrada do substrato V max diminui Km conservado Software

32 Inibição Competitiva V V máx Sem inibidor Inibidor [x] V máx 2 Inibidor [2x] K M1 K M2 K M3 [S] K M1 < K M2 < K M3

33 Inibição Competitiva Nestas reações, - A velocidade inicial DIMINUI de acordo com a quantidade de inibidor - A VELOCIDADE MÁXIMA se mantém, mas é atingida com MAIORES concentrações de substrato. - Portanto, aumentando a concentração de substrato revertese a inibição. - O K M AUMENTA com a concentração do Inibidor Portanto, aparentemente, a afinidade da Enzima pelo Substrato diminui

34 Inibição Não Competitiva V V máx Sem inibidor V máx Inibidor [x] V máx Inibidor [2x] K M1 K M2 [S] K M3

35 Inibição Não Competitiva Nestas reações, - A velocidade inicial DIMINUI de acordo com a quantidade de inibidor - A VELOCIDADE MÁXIMA varia em função da concentração do INIBIDOR -O aumento da concentração de substrato NÃO reverte a inibição (Lembrar que ESI não gera Produto) - O valor de K M NÃO varia - Portanto, a afinidade da Enzima pelo Substrato se mantém

36 Enzimas Alostéricas Compostas por 2 ou mais subunidades (estrutra quaternária) Cada subunidade contém um sítio ativo Sítio ativo As enzimas alostéricas apresentam-se sob a forma ativa e inativa Forma Ativa (liga o substrato) Forma Inativa (não liga o substrato)

37 Cinética Cooperatividade do Substrato Curva V x [S] não Michaeliana A ligação de uma molécula de S, estabiliza a forma ativa e permite a entrada de mais moléculas de S

38 Moduladores Alostéricos Modificam a atividade de Enzimas Alostéricas Ativador Modulador alostérico positivo Sítio alostérico Sítio ativo Sítio alostérico Inibidor Modulador alostérico negativo

39 Efeito de um ativador e um inibidor em uma enzima alostérica

40 Não confundir Inibidor Não Competitivo de uma enzima Michaeliana com Inibidor de uma enzima Alostérica

41 Inibidores e Ativadores alostéricos são muito importantes na regulação de Vias Metabólicas

42 Aplicações de enzimas nas análises clínicas e na terapêutica Enfarto agudo - A concentração plasmática de creatina quinase (CK), aumenta cerca de seis vezes, entre o primeiro e o segundo dia. Hepatite - Transaminases: ALT (alanina aminotransferase) e AST (aspartato aminotransferase) catalisam a transferência reversível dos grupos amino dos aminoácidos. Pancreatite Lipase: catalisa a hidrólise triacilgliceróis em presença de sais biliares e um cofator chamado colipase. É sintetizada pelas células acinares do pâncreas. Câncer de próstata - Fosfatase ácida prostática: exibe ph ótimo entre 4,5 e 7. A maior atividade é encontrada na glândula prostática (1000 vezes maior que em outros tecidos).

43 Exercícios na Sala Multimídia bloco 1 Superior Software de cinética enzimática (3 alunos por computador) Cadastre-se para usar o software. Outros softwares serão usados na disciplina Sugiro acessar Versão on-line