Cinética e regulação enzímica (a velocidade das reacções enzímicas in vivo e in vitro)

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1 Cinética e regulação enzímica (a velocidade das reacções enzímicas in vivo e in vitro) Conceitos de substrato de via metabólica, coenzima, grupo prostético e cofactor. Os conceitos de substrato da via metabólica e coenzima só têm sentido se analisamos uma via metabólica no seu contexto celular. Na glicólise o substrato da via metabólica é a glicose que se consome gerando piruvato ou lactato... Os outros reagentes intervenientes (NAD +, por exemplo) são também substratos das enzimas... Mas na células a concentração do somatório NADH + NAD + é de alguns µm e a via glicolítica só pode ter lugar se o NADH for reoxidado a NAD +. O NADH e o NAD + (assim como o NADPH e o NADP + e coenzima A) costumam designar-se como coenzimas: olhadas no contexto do ser vivo inteiro não se consomem no metabolismo mantendo uma concentração estacionária. Os conceitos de apoenzima, grupo prostético e holoenzima podem ser definidos fora do contexto de uma via metabólica. O grupo prostético é um resíduo não aminoacídico ligado de forma estável (frequentemente covalente) à apoenzima. Exemplos: () O FAD nas desidrogénases dependentes do FAD () A biotina em determinadas carboxílases O conceito de cofactor é o menos preciso. Cofactor é uma substância (orgânica ou não) que não se encontra ligada de forma covalente à enzima, é essencial ao processo catalítico mas...não é reagente nem produto da reacção. Exemplo: as reacções em que intervém o ATP exigem a presença de Mg + (que podemos designar de cofactor) As concentrações dos intermediários do metabolismo variam de indivíduo para indivíduo e com o estado metabólico mas mantêm-se em torno de determinados valores. As concentrações dos intermediários metabólicos dizem-se estacionárias. A concentração de ATP (e a maioria dos outros compostos existentes nos seres vivos) considerando as várias reacções em que intervém como reagente ou produto não está em equilíbrio químico....mas a velocidade do conjunto de reacções que formam ATP é semelhante à velocidade do conjunto de reacções em que este se gasta... existe nas células uma concentração estacionária de ATP. No entanto, muitos autores usam a palavra cofactor para designarem compostos que definimos como grupo prostético ou como coenzima. Os mecanismos que permitem manter estas concentrações estacionárias são muito complexos e designam-se homeostáticos. 4

2 As enzimas são sensores do ambiente onde se encontram variando qualitativamente e/ou quantitativamente a sua actividade em função de variações nesse ambiente. A As enzimas que catalisam reacções fisiologicamente reversíveis catalisam a conversão líquida no sentido directo ou inverso de acordo com a lei da acção das massas mas não são determinantes no sentido nem na velocidade global da via metabólica... S,, P As enzimas marca passo (ou reguladoras) de uma via metabólica catalisam reacções fisiologicamente irreversíveis e a sua actividade determina a velocidade de fluxo nessa via metabólica. Estas enzimas têm baixa actividade... B 5 Nos seres vivos a velocidade das reacções pode ser regulada por vários mecanismos envolvendo () quer o número de moléculas de enzima presente na célula () quer a capacidade catalítica dessas moléculas. Os mecanismos de regulação da actividade enzímica mais importantes nas células são: - Quantidade de enzima: a síntese de uma enzima pode ser regulada ao nível da expressão do gene que a codifica. - Concentração de substrato - Modificação alostérica 4- Modificação covalente Independentemente do mecanismo envolvido dizemos que a actividade enzímica de uma determinada enzima aumentou se a velocidade da reacção que ela catalisa aumentou (e vice-versa). 6 Quando se quer quantificar a actividade de uma enzima adicionamos num tubo de ensaio a enzima ao(s) substrato(s) e vamos observando ao longo do tempo como evolui a reacção. Produto (micromoles).5.5 /min,5/min tempo (min),/min O normal é que (por motivos vários) a reacção se vá lentificando. Quando se atingir o equilíbrio químico ou se esgotar o substrato a velocidade será zero mas actividade enzímica = velocidade da reacção enzímica Produto (micromoles) Actividade azul (v ou ) = µmole / min 4 5 Tempo (min) Admitamos que fizemos dois ensaios idênticos mas com duas amostras diferentes da mesma enzima E: amostra azul amostra vermelha Em qual das amostras a enzima E tinha maior actividade? Como podemos exprimir quantitativamente a actividade da enzima E na amostra azul? Se respondessemos: actividade = µmoles/5 min =,6 µmoles/min... estariamos a falar da velocidade média nos 5 min de ensaio e a dizer que nas duas amostras a actividade era igual. Para a concentração de substrato em que o ensaio se iniciou a velocidade será o declive da curva produto formado versus tempo no tempo zero (v ou ) mas poderemos considerar que, pelo menos no caso do ensaio azul, uma boa estimativa 8 de v pode ser a velocidade média no primeiro minuto de ensaio ( µmole/min).

3 Em teoria a actividade enzímica de uma enzima (num sistema de ensaio especificado e adequado) define-se como o aumento de velocidade de conversão (S P) induzido pela enzima. Actividade = = velocidade na presença de enzima - velocidade na sua ausência NaOH incubar substrato na presença de Fosf Alc. durante um tempo t incubar substrato na ausência de Fosf Alc. durante um tempo t NaOH ler Absorvância no ensaio enzímico ler Absorvância no ensaio a branco A realização de ensaios a branco (sem enzima) permite prevenir a eventualidade de ocorrer reacção não enzímica. Ao subtrair o branco... também se subtrai o produto que 9 eventualmente se tenha formado na ausência de enzima. Como variará se duplicarmos (ou triplicarmos...) a concentração de enzima num ensaio enzímico? A actividade enzímica ( ou uma boa estimativa de ) num meio especificado e adequado é proporcional à quantidade de enzima. v inicial kcat = Km + [ S] [ ] [ E ] total S se fizermos ensaios nas mesmas condições (temperatura, ph, etc.) k cat e Km são constantes; se também usarmos a mesma concentração de substrato [S] este factor é constante v = const. [ ] inicial E total Produto (micromoles) Qual a quantidade de enzima E no ensaio vermelho? 4 5 Tempo (min) UI (unidade internacional) = quantidade de enzima que catalisa a conversão de µmol de substrato em produto / min Embora, pelo menos teoricamente, a quantidade de uma enzima possa ser medida em moles ou em gramas, é mais frequente medir a quantidade de enzima como uma velocidade de reacção; a velocidade da reacção catalisada pela enzima em análise (idealmente no tempo zero; ). Admitindo que ) a enzima E catalisa a reacção X Y ) o tubo de ensaio A continha ml de solução ) no tempo zero se adicionou µl de soro 4)... e se foi medindo a quantidade X ao longo do tempo Qual a actividade da enzima E no soro em análise? ) No tubo A nos primeiros min a concentração de X passou de para 9 mm = diminuiu mm (ou µm) ) µm *, L = µmoles de X convertido em Y ) µmol de X/ min = µmol / min 4) UI / µl soro Notar que no tubo B se adicionou um volume diferente do mesmo soro. Porque a velocidade de reacção observada em B era metade da observada em A quer dizer que em B havia metade do número de moles da enzima E. Ou seja, em B o volume de soro era,5 µl.

4 Quando se doseiam enzimas numa preparação que a contém (usando a actividade como medida da quantidade de enzima) pressupõe-se que a actividade ( ) é proporcional à quantidade de enzima. Pâncreas inflamado liberta amílase para o sangue Em química clínica doseiam-se com frequência enzimas no soro (por exemplo a amílase do soro em situações em que se suspeita de pancreatite aguda) exprimindo o resultado do ensaio enzimático em velocidade de reacção / volume de soro Porque as condições de ensaio (concentração e natureza dos substratos, ph, natureza do tampão, temperatura, etc.) podem não ser iguais em dois laboratórios distintos os valores normais de um laboratório podem não ser iguais aos de outro laboratório. mol de glicose é mol de glicose em qualquer sítio do mundo mas UI de amílase (ou outra enzima qualquer) em dois laboratórios distintos pode significar diferentes quantidades de enzima. A actividade enzímica aumenta se o número de moléculas de enzima aumentar (e vice-versa). O doseamento de uma enzima em tecidos pode servir para estudar o efeito de hormonas na síntese dessa enzima. Glicose-6- fosfátase no Voice et al. (99) BST :7S A insulina inibe a expressão de genes que codificam enzimas envolvidas na produção de glicose como, por exemplo, o gene da glicose- 6-fosfátase. Quando há muita insulina o número de moléculas de glicose-6-fosfátase diminui porque diminui a transcrição do seu gene. Quando há pouca insulina o número de moléculas de glicose- 6-fosfátase aumenta pela razão oposta. Nestes casos, para comparar ensaios com amostras diferentes, é costume expressar a concentração de enzima em UI/g de tecido 4 (, por exemplo) ou UI/mg de proteína. Porquê expressar actividade em UI / massa de tecido (ou UI / mg de proteína)? Permite comparar dois ensaios enzímicos em que se usam concentrações de enzima distintas... mg de Homogeneizado de mg de Quando se doseia uma enzima necessitamos de um meio de ensaio que contém obrigatoriamente o substrato (ou substratos) da enzima...mas em diferentes laboratórios podem usar-se diferentes temperaturas de ensaio. ºC 7ºC Aumentar a temperatura aumenta a velocidade das reacções incluindo a velocidade de desnaturação das enzimas. µmol/min = UI µmol / min = UI UI mg de UI mg de Actividade específica = UI / mg de Actividade específica = UI / mg de 5 O exemplo da figura indica que se se pretendesse dosear a enzima em questão poderia ser 6mais cómodo escolher para temperatura de ensaio ºC...

5 Para dosear uma enzima, para além da temperatura, também se escolhem outras condições de ensaio como, por exemplo, o ph do meio de ensaio. Quando doseamos uma enzima costuma escolher-se para ph de ensaio um valor próximo do ph óptimo dessa enzima. Se na amostra enzímica existirem duas enzimas que catalisem a mesma reacção mas essas enzimas tiverem phs óptimos distintos posso, escolhendo o ph de ensaio, estudar uma ou outra dessas enzimas. ph 7 favorece isoenzima vermelha ph favorece isoenzima azul 7 Para dosear uma enzima, para além da temperatura e do ph, também se escolhe a concentração do substrato. Eventualmente podemos fazer vários ensaios usando diferentes concentrações do substrato. Considerar apenas um substrato é uma simplificação (estritamente só as isomérases têm um substrato)...mas podem fixar-se as concentrações dos outros substratos e estudar-se como varia a actividade ( )... em função da variação da concentração de um deles. 8 A actividade de uma enzima aumenta com a concentração de substrato......mas para concentrações altas (saturantes) aumentar a concentração de substrato praticamente não afecta a actividade. = k cat [ ] A actividade é proporcional à concentração do complexo E S (k cat é a constante de proporcionalidade) Para diferentes enzimas o aspecto do gráfico actividade versus [S]... pode ser hiperbólico ou sigmoide... mas a característica saturabilidade está sempre presente. 9 Num grande número de enzimas o gráfico versus [S] tem o aspecto de uma hipérbole que se ajusta à equação de Michaelis-Menten V [ S] = max Km + [ S] As enzimas com cinéticas de tipo hiperbólico são aquelas em que o gráfico versus [S] pode ser ajustado a uma equação do tipo [ ] v V S = max inicial Km + [ S]... sendo que Vmax e Km são constantes (...se a única condição de ensaio que varia é [S])