Hidrólise da ureia pela urease

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1 Hidrólise da ureia pela urease DQB

2 Velocidade de uma reacção enzimática DQB Para cada case do utilização de um enzima para catálise de uma dada reacção é necessário conhecer a estequiometria da reacção aa bb cc c d [ C] d[ A] d[ B] dt a dt b dt e da sua dependência com: - Concentração enzima - Concentração do(s) substrato(s) - Presença de inibidores e sua concentração - Presença de actiadores e sua concentração - Força iónica do meio reaccional - ph (actiidade enzimática e estabilidade) - Temperatura (actiidade enzimática e estabilidade) - ndirectamente do tempo de reacção, isto é, acumulação e concentração do(s) produto(s) da reacção.

3 Velocidade de uma reacção enzimática DQB Função da concentração de substrato

4 Velocidade de uma reacção enzimática DQB Função da concentração de substrato

5 Velocidade de uma reacção enzimática DQB Função da concentração do enzima

6 Velocidade de uma reacção enzimática DQB Função do ph ph óptimo ph

7 Velocidade de uma reacção enzimática DQB Função do ph O ph óptimo da actiidade de um enzima está próximo do ph do ambiente em ph óptimo que o enzima é normalmente encontrado, por exemplo: (a)pepsina que hidrolisa certas ligações peptídicas de proteínas durante a sua digestão no estômago tem um ph óptimo de,6. (b) Glucose 6-fosfatase de células do fígado (hapatócitos) com um ph ph óptimo de ~ 7,8 é responsáel pela libertação de glucose na corrente sanguínea. O ph normal no citosol de células de hepatócitos é ~7,.

8 DQB Noções Gerais sobre Cinética, exprime-se como a elocidade de alteração da quantidade de uma substância intereniente na reacção, presente na mistura reaccional. De um modo geral, para, aa bb cc tem-se; c d [ C] d[ A] d[ B] dt a dt b Com a lei cinética obtêm-se uma expressão matemática que mostre como é que a elocidade medida depende das concentrações dos reagentes (e produtos, se a reacção inersa ocorrer com elocidade apreciáel). dt

9 DQB Noções Gerais sobre Cinética Por exemplo, se a elocidade da reacção A B C ariar linearmente com as concentrações de A e B, tem-se: [ C] d dt [ A][ B] em que é a constante cinética para a reacção indicada. De uma forma geral pode escreer-se [ C] d dt [ A] α [ B] β em que α e β definem a chamada ordem da reacção em relação a A e B, respectiamente.

10 Noções Gerais sobre Cinética DQB À soma θ α β chama-se ordem global da reacção. Para uma reacção de ordem global θ, as unidades da constante cinética são [concentração -θ x tempo - ]. Tabela xpressões cinéticas para reacções de ordem global entre zero e dois Reacção Ordem Lei Cinética t semi-tranformação A B 0 d[ A] [ A] [ A] t t A 0 A B A A B ª ª dt d[ A] dt d[ A] dt [ A ] 0 A A e t t A A [ A] 0 0 / ln t / t / A 0

11 DQB A B Velocidade de uma reacção enzimática Função da temperatura d A A dt quação de Arrhenius - é constante da elocidade, - R é constante da lei dos gases, - A é factor de frequência, - A à energia de actiação da reacção.

12 DQB A B Velocidade de uma reacção enzimática Função da temperatura d A A dt quação de Arrhenius - é constante da elocidade, - R é constante da lei dos gases, - A é factor de frequência, - A à energia de actiação da reacção.

13 Actiidade nzimática: quação de Base xperimental DQB V V máx reacção de ordem zero / V máx reacção de ª ordem P C cat Para []<<, cat C Para []>>, cat C V máx Figura - Cura de progressão de uma reacção enzimática

14 Cinética de ichaelis-enten DQB Reacção inicial, a concentração de produto é desprezáel e, por isso, pode ignorar-se a reacção inersa de formação de a partir de P A combinação do enzima com o substrato é instantânea para dar um complexo enzima-substrato,. ste passo é considerado, neste esquema, rápido e reersíel (equilíbrio) Balanço ao enzimas C A conersão do complexo em P é muito lenta, não alterando o equilíbrio anterior ( << -). V Vmáx C V máx, d P dt C P - [? ] C C

15 Determinação dos parâmetros cinéticos de ichaelis-enten DQB V Vmáx /V Pela equação de Lineweaer-Bur resultante da inersão da ichaelis-enten /V máx coeficiente angular /V máx V máx V máx abcissa -/ [ / ] Pela equação de adie-hofstee multiplicar anterior por Vmax Vmáx ordenadavmáx coeficiente angular - V máx V máx / /[]

16 Determinação dos parâmetros cinéticos de ichaelis-enten DQB 0,6 m (o-npg) V max 78 µmole o-npg/l.min

17 Cinética de Briggs Haldane DQB Briggs e Haldane examinaram o caso em que, no esquema de ichaelis-enten, era comparáel a -,, logo a hipótese da existência de equilíbrio rápido não é álida. P d V máx as, aplicando a aproximação do estado estacionário à concentração de : dt [ ] ) 0 Do balanço ao enzimas [ P] d dt C V Vmáx C A elocidade de formação do produto. C. [?] /( C ( ) C

18 Actiidade nzimática DQB ignificado da constante catalítica ( cat ) No mecanismo de ichaelis enten cat é a constante cinética de ª ordem para a conersão química de em P. Para casos mais complexos, é uma função de todas as constantes cinéticas de ª ordem costume relacionar cat com o turnoer number, que representa o número máximo de moléculas de substrato que se podem conerter em produtos por centro actio do enzima e por unidade de tempo, e é expresso em s -. turnoer number n cat Vmáx C n sendo n o número de centros actios por molécula de enzima. Como regra, pode-se considerar que cat é uma constante cinética de ª ordem que se refere às propriedades e reacções dos complexos enzima-substrato, enzimacomposto intermediário e enzima-produto.

19 DQB Actiidade nzimática turnoer number n cat C n

20 DQB aparece como uma constante cinética aparente de segunda ordem. ste quociente relaciona a elocidade da reacção com a concentração do enzima lire. Por exemplo, para baixas concentrações de substrato, o enzima está em grande parte lire e C []. A constante designa-se por constante de especificidade uma ez que este quociente traduz a especificidade para substratos que estejam em competição para se ligarem ao enzima. ignificado da constante ( cat / ) No mecanismo de ichaelis enten para baixas concentrações de substrato ([]<< ): cat cat C onde De facto, se tiermos dois substratos A e B competindo para o centro actio do enzima: cat [ A] A A B cat [ B] B o poder discriminatório do enzima em relação a dois substratos, é determinado por cat /.

21 DQB cat ignificado da constante ( cat / ) C

22 DQB cat ignificado da constante ( cat / ) C

23 DQB cat ignificado da constante ( cat / ) C Há uma dependência da reacção catalisada pela quimotripsina com o ph e neste caso manifestase ao níel dos alores de cat e : - A elocidade da reacção aumenta para ph > 7,0 deido ao aumento do cat. - A elocidade da reacção diminui para ph > 8,5 deido à diminuição do /. - sta dependência é deida à intima relação entre cinética e estrutura do centro actio, em particular ao estado de ionização da His 57 enolida na ligação do substrato. - No ph óptimo da reacção (ph 8,0) a His 57 dee estar desprotonada (pa ~ 6,0).

24 nteracções do enzima com actiadores e inibidores DQB

25 nteracções do enzima com actiadores e inibidores DQB Actiadores m enzimas alostéricos o sítio de ligação do substrato (subunidade catalítica C) e do actiador (subunidade reguladora R) são diferentes: - A ligação do actiador () ao seu sitio específico na subunidade reguladora é comunicada à subunidade catalítica por uma alteração da sua conformação espacial. - é esta alteração conformação espacial que permite à sub-unidade catalítica reconhecer o substrato com eleada afinidade. - A dissociação do actiador ao subunidade reguladora conerte o enzima numa forma conformacional não actia ou menos actia.

26 nteracções do enzima com actiadores e inibidores DQB nibidores rreersíeis Reacção da quimotripsina com di-isopropil fluoro fosfato (DFP) inibe irreersielmente a actiidade do enzima e leou à conclusão de que a er 95 é um resíduo de amino ácido chae no processo catalítico.

27 nteracções do enzima com actiadores e inibidores DQB nibição da Actiidade nzimática (nibidores reersíeis)

28 nibição da Actiidade nzimática na cinética Briggs-Haldane nibição competitia P b C [][][] C / / [] -/` DQB C C C

29 DQB nibição da Actiidade nzimática P nibição não competitia b b C [][][] [] C [ ] [ ] / C [ ] [ ] [ ] /V máx / [ ] V máx V máx [ ]

30 nibição da Actiidade nzimática DQB b P nibição anticompetitia C C[][][], / /V máx C -/` / [ ]

31 nibição pelo ubstrato DQB P b [ ] C ' Para baixas concentrações de ([]<< ) a equação é de ª ordem em []: C ' ' C P Para eleadas concentrações de ([]>> ): C C [] inactio

32 nibição pelo ubstrato DQB A equação de Lineweaer-Bur teria o seguinte aspecto: / declie V ' máx /V máx -/ ' /[]