Aplicações de Enzimas e Biocatálise

Transcrição

1 Aplicações de Enzimas e Biocatálise Estabilidade enzimática Raúl J. Barros 2012

2 Uma preparação enzimática geralmente perde atividade ao longo do tempo, à medida que as moléculas proteicas que a constituem vão sofrendo alterações que gradualmente diminuem o teor de enzima ativo. Assim, uma dada preparação enzimática pode ter uma atividade num dado momento, e mantida nas mesmas condições, vai perdendo atividade. Quanto mais lenta essa perda de atividade mais estável é a preparação. 2

3 A perda de atividade depende das condições de incubação da preparação enzimática. Os mecanismos que levam à perda de atividade podem ser vários: Desnaturação térmica das proteínas Oxidação Proteólise Outras reações com compostos do meio 3

4 Vários fatores ambientais influenciam a perda de atividade enzimática: Temperatura: Quanto mais alta mais rápida a perda de atividade ph: Para cada preparação existe um valor ótimo de estabilidade (pode ser diferente do ótimo de atividade). Quanto mais afastado desse ótimo mais rápida a perda de atividade. Diluição: Quanto mais diluída a preparação mais rápida a perda de atividade. 4

5 Fatores ambientais que influenciam a perda de atividade enzimática: Presença de ligandos: Na presença de substratos, inibidores ou outros ligandos, geralmente a estabilidade é melhor. Potencial redox: Os enzimas são mais estáveis em condições redutoras do que em condições oxidantes. Cofatores: A destruição de cofatores leva à perda de atividade mesmo que a conformação nativa do enzima não seja alterada. 5

6 Fatores ambientais que influenciam a perda de atividade enzimática: Presença de iões metálicos: Certos iões (Ca 2+, Mg 2+, Zn 2+, etc) podem ser necessários para manter a conformação do enzima ou mesmo agir como cofatores. A sua ausência no meio pode levar a uma perda rápida de atividade. A presença de quelantes (p. ex. EDTA ou ácidos orgânicos) pode ter um efeito semelhante. Presença de agentes desnaturantes: Ureia ou Cloreto de guanidilo provocam uma rápida perda da atividade enzimática por provocarem o desenrolamento das cadeias peptídicas. 6

7 Fatores que influenciam a perda de atividade enzimática: De uma forma geral as condições que melhoram a rigidez conformacional das moléculas proteicas conduzem a uma maior estabilidade do enzima. 7

8 Um pouco de revisão sobre estrutura de proteínas: A conformação nativa de uma proteína (estruturas secundária, terciária e/ou quaternária) é mantida à custa de numerosas interações intramoleculares e intermoleculares das cadeias peptídicas que constituem as proteínas (cadeia principal, cadeias laterais, ligandos, etc.). 8

9 Um pouco de revisão sobre estrutura de proteínas: Essas interações podem ser: Eletrostáticas Pontes de Hidrogénio Forças de Van der Waals Hidrofóbicas Pontes dissulfureto 9

10 Um pouco de revisão sobre estrutura de proteínas: A energia individual de cada uma dessas interações é muito pequena, mas no seu conjunto conseguem manter a configuração nativa do enzima, num equilíbrio dinâmico: mesmo que algumas das interações sejam momentaneamente afetadas, todas as restantes ajudarão a manter a molécula numa configuração de equilíbrio que permite a manutenção da atividade (que depende totalmente da estrutura). 10

11 Um pouco de revisão sobre estrutura de proteínas: Pontualmente, as oscilações na estrutura da molécula podem levar ao seu desenrolamento, com consequente perda de atividade. Essa desnaturação pode ser reversível ou irreversível. Normalmente os mecanismos irreversíveis ocorrem com mais facilidade nas cadeias peptídicas desenroladas do que nas nativas. 11

12 Relação da estrutura de proteínas com a estabilidade: Os mecanismos de inativação são os atrás descritos. Toda e qualquer transformação que leve a uma alteração significativa da conformação da proteína na vizinhança do centro ativo conduz a perda de atividade. 12

13 Mecanismo geral de inativação enzimática: Geralmente considera-se que a perda de atividade enzimática ocorre através de dois passos sucessivos: um primeiro reversível, que corresponde a um desenrolamento da cadeia peptídica, e um segundo irreversível, correspondente a alterações que impedem o enzima de recuperar a atividade. 13

14 Mecanismo geral de inativação enzimática: Admite-se geralmente que a velocidade do segundo passo é muito mais lenta, não afetando significativamente o equilíbrio entre o enzima nativo e o enzima reversivelmente desnaturado: K k E a E d i E i Neste esquema E a representa o enzima na configuração nativa, E d representa o enzima reversivelmente desnaturado e E i representa o enzima irreversivelmente desnaturado (inativado). 14

15 Mecanismo geral de inativação enzimática: Os parâmetros de equilíbrio e cinético são: K é a constante de equilíbrio da desnaturação reversível, K = [E d ]/[E a ]. k i é a constante de velocidade do passo irreversível, d[e i ]/dt = k i.[e d ] Quer K quer k i aumentam com o aumento da temperatura, daí que a inativação enzimática seja mais rápida a temperaturas elevadas. 15

16 Mecanismo geral de inativação enzimática: No que respeita ao equilíbrio, se definirmos [E] como o teor de enzima não inativado, podemos escrever: [E] = [E a ] + [E d ]. Acoplando a equação de equilíbrio (K = [E d ]/[E a ]) pode deduzir-se: [E a ] = [E]/(1+K) e [E d ] = K[E]/(1+K) 16

17 Mecanismo geral de inativação enzimática: A partir das equações anteriores é fácil deduzir as expressões para as frações de enzima livre e desnaturada: f a =[E a ]/[E] = 1/(1+K) e f d =[E d ]/[E] = K/(1+K) Assim, quanto maior for o K maior a fração de enzima desnaturado. O K cresce com aumento de temperatura ou com o estabelecimento de condições no meio que estabilizem a forma desnaturada em relação à nativa. 17

18 Mecanismo geral de inativação enzimática: Quanto ao passo irreversível: Como já foi escrito atrás: d[e i ]/dt = k i.[e d ] Como constante cinética, será de esperar de k i um comportamento com a temperatura de acordo com a equação de Arrhenius: k i = Ae E a RT k i também pode depender doutras condições do meio: ph, potencial redox, concentrações de reagentes, ligandos, quelantes, metais, atividade da água e outros. 18

19 Mecanismo geral de inativação enzimática: O aparecimento de enzima irreversivelmente desnaturado corresponde ao desaparecimento do conjunto das outras formas: d[e i ]/dt = - d([e a ]+[E d ])/dt = - d[e]/dt. Por outro lado: [E d ] = K[E]/(1+K) 19

20 Mecanismo geral de inativação enzimática: Substituindo as duas últimas equações na anterior, fica: - d[e]/dt = k i.k[e]/(1+k) À combinação k i.k/(1+k),podemos chamar constante de desativação (k d ), o que resulta na equação: - d[e]/dt = k d.[e] Esta equação indica que é de esperar que a perda de atividade siga uma cinética de 1ª ordem. 20

21 Mecanismo geral de inativação enzimática: Integrando esta equação: Obtém-se: - d[e]/dt = k d.[e] E t = E 0 e k d.t A atividade enzimática deverá tender exponencialmente para zero com constante cinética k d. 21

22 Mecanismo geral de inativação enzimática: O tempo de meia vida (t 1/2 ) da atividade enzimática corresponde ao tempo decorrido até que a atividade seja metade da inicial: E 0 2 = E 0e k d.t 1/2 1 = 2e k d.t 1/2 0 = ln 2 k d. t 1 2 t 1 2 = ln (2)/k d 22

23 Relação com a atividade enzimática: Em condições ótimas de funcionamento o tempo que decorre para que haja perda significativa de atividade é bastante mais longo que um típico ciclo de reação em batch. Daí que para cada ciclo de uma reação em descontínuo se considere que a atividade enzimática é praticamente constante. Em caso de reutilização do enzima em vários ciclos há que contabilizar a atividade do enzima em cada um deles. 23

24 Relação com a atividade enzimática: Em condições extremas de funcionamento, por exemplo temperaturas elevadas, pode haver uma extensa perda de atividade no tempo em que decorre a reação. Quanto mais alta a temperatura mais elevada a velocidade da reação (Arrhenius), mas também mais rápida a inativação, pelo que ambos os efeitos contribuem para a observação da atividade. Não existe um ótimo de T!!! Retirado de Fundamentals of Enzyme Kinetics, Cornish-Bowden 24

25 Um pouco de termodinâmica: A constante de equilíbrio da desnaturação reversível (K) relaciona-se com a energia livre de Gibbs desse processo (DG) através da relação: G = R. T. lnk Nesta equação R é a constante dos gases ideais (1,987 cal.mol -1.K -1 ) e T é a temperatura absoluta (em K). 25

26 Um pouco de termodinâmica: A energia livre de Gibbs, por sua vez, varia com a temperatura através da relação: G = H T. S Onde DH e DS são as variações entálpica e entrópica da desnaturação, respetivamente. Esta equação indica que uma representação de DG em função da temperatura deverá resultar numa reta de ordenada na origem igual a DH e declive igual a DS. 26

27 Um pouco de termodinâmica: DH pode ser considerada a energia das ligações que mantêm a proteína na conformação nativa, ao passo que DS se relaciona com os graus de liberdade de cada uma das conformações, que serão maiores na forma desnaturada (desenrolada). Ambos os parâmetros são positivos para um processo de desnaturação reversível, pelo que será de esperar que DG vs T seja uma reta com ordenada na origem positiva e declive negativo. 27

28 Um pouco de termodinâmica: A reta: G = H T. S terá um ponto de interseção com o eixo das abcissas (DG = 0) no ponto T m = DH/DS. T m é chamada a temperatura do ponto médio da desnaturação térmica. É a temperatura à qual DG = 0, o que significa que a constante de equilíbrio da desnaturação reversível será 1, e portanto teremos iguais concentrações de enzima nativo e enzima reversivelmente desnaturado. 28

29 Influência na performance de reatores: Em caso de perda de atividade significativa a equação que descreve o comportamento de um reator descontínuo tem de ser adaptada para ter em conta essa diminuição de atividade. No caso dos reatores contínuos, com ciclos de operação tipicamente muito longos, se o enzima residir permanentemente no reator (imobilizado) não pode ser desprezada a sua perda de atividade. As equações de dimensionamento dos reatores têm de ser adaptadas. 29

30 Relação com a atividade enzimática: Equação de dimensionamento de um CSTR sujeito a inativação enzimática: k cat E o e k d.t τ = K M X 1 X + S ix Equação de dimensionamento de um PFR sujeito a inativação enzimática: k cat E o e k d.t τ = S i X K M ln 1 X t é o tempo decorrido desde o momento de arranque do reator, quando a concentração de enzima ativo era [E] 0. 30