Biossistemas e Biorreações

Transcrição

1 Biossistemas e Biorreações Prof. Maria Alice Zarur Coelho Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos Escola de Química UFRJ

2 Metabolismo nosso principal ator

3 Top-down versus Bottom-up Petranovic and Nielsen, Trends in Biotechnology (2008)

4 Primeiro Genoma Bacteriano Sequenciado

5 Número de genomas sequenciados

6

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8

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10 Bottom-up metabolic systems biology 1. COMPONENTS Determine the system components (genes, proteins and metabolites) 2. NETWORKS Identify the component interactions (enzyme-substrate, protein-dna) 3. MODELS Develop a system model (qualitative or quantitative) 4. PHYSIOLOGY Model-based design or hypothesis-driven discovery

11 Usos de outros dados de ômicas em modelos de escala genômica

12 Reações Químicas e Bioquímicas Químicas: fase gás frequente. Altas temperaturas e pressões. Bioquímicas: fase aquosa duluída. Temperatura ambiente. Características: Químicas: Estequiometria simples. Cinética por ser baseada em mecanismos detalhados. Transferência de calor e massa são importantes. Bioquímicas: Estequiometria complexa que muda com as condições ambientais. Cinética ainda crua. Transferência de calor e massa são raramente importantes. A célula é o biorreator e a reção é autocatalítica.

13 Estequiometria Síntese de Metanol: CH 4 + H 2 O CO + 3 H 2 2 H 2 + CO CH 3 OH Fermentação com leveduras: CH 2 O NH CH 3 O 1/ CO CH 8/3 O CH 1.74 O 0.60 N H 2 O CH 2 O = glicose (1 C-atom) CH 3 O 1/2 = etanol (1 C-atom) CH 8/3 O = glicerol (1 C-atom) CH 1.74 O 0.60 N 0.12 = biomassa (1 C-atom) A estequiometria muda com T, ph, p O2, c NH3, c CH2O etc.

14 Mas mesmo...a estequiometria das biorreações pode ser modelada A conversão de glicose a biomassa, etanol e glicerol pode ser expressa como três caminhos metabólicos: v 1 = CH 2 O CO 2 + X NADH ATP = 0 v 2 = - 3/2 CH 2 O + CH 3 O 1/2 + ½ CO 2 + ½ ATP = 0 v 3 = - CH 2 O + CH 8/3 O 1/3 NADH 1/3 ATP = 0 Quando os balanços redox (NADH) e energético (ATP) fecham, obtém-se a estequiometria experimental.

15 Processo de produção de solventes usando Clostridium acetobutylicum CO 2 acn EtOH v 2 Glucose CH 2 O 0.5 N 0.25 v 7 v 1 CO 2 PYR v v 4 CO 3 HLac 2 v AcCoA 13 NADH H2 v 5 v 6 CO v 2 8 HAc v 9 AcetoAcCoA ac v 10 HBu BuCoA v 11 v 12 BuOH HBu BuCoA A rede tem 13 fluxos e 4 nós internos: com um balanço de NADH e outro de ATP, 7 taxas podem ser mensuradas para determinar v 1 - v 13

16 Rede Estequiométrica com caminhos diretos

17 Cinética Expressões muito simples podem ser usadas: Estado Estacionário (ou crescimento balanceado): q x = Y px q p = Y sx q s (kg m -3 h -1 ) = x r x r x = k c s (K s + c s ) -1 (kg (kg X) -1 h) -1. Mudanças rápidas no ambiente: Falta de conhecimento do sistema regulatório da célula inibe qualquer construção de uma cinética geral (com base mecanicística). Pedaços da rede de reações podem ser modelados.

18 Exceto pela estequiometria.... projeto dos bioprocessos não é muito diferente daqueles relacionados aos processos químicos convencionais.

19 O conceito da Análise de Fluxo Metabólico (MFA) é útil para estudar as interações entre os diferentes caminhos metabólicos e quantificar as distribuições de fluxo em torno do pontos de bifurcação não possibilita medidas quantitativas do controle do fluxo metabólico!!! O controle do fluxo metabólico é importante para: (i) balancear a taxa de síntese e conversão dos metabólitos face a uma dada condição ambiental não permitindo um aumento ou uma queda catastrófica nas concentrações intracelulares destes compostos (ii) modificação racional dos fluxos metabólicos

20 Mecanismos moleculares que possuem papel importante no controle do fluxo metabólico (1950 s): Inibição por feed-back Cooperatividade enzimática Modificações enzimáticas por ligação covalente Controle da síntese enzimática Controle metabólico normalmente é descrito de forma qualitativa, i.e.: fosfofrutoquinase é a enzima que controla a maior parte do fluxo glicólitico nos músculos. ou o primeiro passo de uma caminho metabólico é a taxa cinética limitante. Não necessariamente correto!!!

21 Regulação da Atividade Enzimática Controle da Disponibilidade Enzimática: A quantidade de uma dada enzima na célula depende da sua taxa de síntese e da sua taxa de degradação Controle da Atividade Enzimática: A atividade catalítica de uma enzima pode ser diretamente regulada por meio de alterações conformacionais ou estruturais

22 Aspartato transcarbamoilase (ATCase) ligação cooperativa homotrópica positiva para ambos os substratos heterotropicamente inibida pela cistidina trifosfato (CTP) heterotropicamente ativado pela adenosina trifosfato (ATP) H 2N CO OPO OCO CH 2 CH COO - ATCase - OCO CH 2 CH COO - NH 3 + NH carbamoil fosfato aspartato H 2N CO + H 2PO 4 -

23 Mudanças conformacionais na ATCase

24 Enzimas Alostéricas e com Múltiplos Sítios Ativos A presença do substrato em um dos sítios influencia: - a ligação do substrato aos demais sítios vazios - a taxa de formação de produto nos sítios ocupados O próprio substrato atua como um modificador ou um efetor Ativação (incluindo respostas sigmoidais de v verus [S]) ou Inibição

25 Sítios não-cooperativos K S E + S + + S S ES K P E + P K S K S E + P K P SE + S K S SES K P SE + P K P ES + P v V MAX = 1+ [S] K S 2[S] K S + [S] K S [S] K 2 2 S V = MAX 2K P [E] t K S - constante de dissociação intrínseca

26 Constante de dissociação intrínseca constante de um sítio isolado, ou seja, a constante cinética de um sítio desconsiderando sua associação com os demais sítios da mesma molécula enzimática descreve o equilíbrio entre o substrato livre, o sítio ativo livre e o complexo sítio-substrato Constante de dissociação efetiva descreve o equilíbrio entre o substrato livre, enzima disponível e o complexo enzima-substrato

27 Ligações cooperativas Se a ligação de uma molécula de substrato induz a mudanças estruturais ou eletrônicas que resultam em alterações nas afinidades dos sítios vazios a curva de velocidade não seguirá mais o modelo cinético de Henri-Michaelis-Menten Enzima Alostérica (curvas de velocidade sigmoidais)

28 Aumento das afinidades dos sítios vazios de ligação: ligação cooperativa ou cooperatividade positiva com respeito a ligação do substrato, ou resposta homotrópica positiva Interações entre substrato e inibidor ou substrato e ativador: respostas heterotróficas positivas (ativador) ou negativas (inibidor)

29 Resposta sigmoidal à variação do substrato proporciona um maior controle da taxa de reação pelas variações na concentração de substrato

30 Modelos de Interação Seqüencial assumem mudanças seqüenciais ou progressivas nas afinidades dos sítios vazios a serem ocupados Modelos de Simetria Orquestrada a enzima pré-existe como uma mistura em equilíbrio de oligômeros de alta afinidade e oligômeros de baixa afinidade

31 Distribuição das espécies enzimáticas enzima com 4 sítios catalíticos idênticos e sem cooperatividade enzima com 4 sítios catalíticos onde a ligação de cada molécula de substrato aumenta as constantes de ligação dos sítios vazios isocitrato desidrogenase - NAD dependente (leveduras)

32 Equação de Hill v V = [S] n n MAX K' + [S] n = número de sítios de ligação ao substrato por molécula de enzima K = K Sn (a n-1 b n-2 c n-3...z 1 ) = constante envolvendo os fatores de interação (a, b, c,... z) e a constante de ligação intrínseca dv d[s] = nk' V MAX (K' + [S] [S] n ) n 1 2 d 2 v / d[s] 2 = 0 - ponto de inflexão

33 E ES ou SE SES + S S + S S S Modelo Genérico de Interação Seqüencial de Koshland- Nemethy-Filmer A 2 BSA ou ABS B 2 S 2 Modelos tetraédricos: Modelos lineares: Modelos quadráticos:

34 Modelo de Geometria Orquestrada (Monod, Wyman e Changeux) T representa a conformação de baixa afinidade em equilíbrio com R a forma da enzima de alta afinidade

35 Modelos Híbridos primeira coluna - modelo de simetria orquestrada quarta coluna - modelo de interação seqüencial