Biossistemas e Biorreações

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1 Biossistemas e Biorreações Prof. Maria Alice Zarur Coelho Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos Escola de Química UFRJ

2 O conceito da Análise de Fluxo Metabólico (MFA) é útil para estudar as interações entre os diferentes caminhos metabólicos e quantificar as distribuições de fluxo em torno do pontos de bifurcação não possibilita medidas quantitativas do controle do fluxo metabólico!!! O controle do fluxo metabólico é importante para: (i) balancear a taxa de síntese e conversão dos metabólitos face a uma dada condição ambiental não permitindo um aumento ou uma queda catastrófica nas concentrações intracelulares destes compostos (ii) modificação racional dos fluxos metabólicos

3 Mecanismos moleculares que possuem papel importante no controle do fluxo metabólico (1950 s):! Inibição por feed-back! Cooperatividade enzimática! Modificações enzimáticas por ligação covalente! Controle da síntese enzimática Controle metabólico normalmente é descrito de forma qualitativa, i.e.: fosfofrutoquinase é a enzima que controla a maior parte do fluxo glicólitico nos músculos. ou o primeiro passo de uma caminho metabólico é a taxa cinética limitante. Não necessariamente correto!!!

4 Análise do Controle Metabólico (MCA) Ao invés de assumir a existência de uma única etapa limitante, assume-se que existe uma quantidade definida do controle do fluxo metabólico se encontra espalhada ao longo do caminho através das enzimas, sendo formalmente conhecido como Teoria do Controle Metabólico, intimamente relacionada com Análise de Sensibilidade. Na essência, MCA é aplicação da teoria da perturbação linear de um problema inerentemente não-linear da cinética enzimática das redes metabólicas. Abordagens possíveis para o estudo do comportamento cinético de sistemas multienzimáticos: Teoria orientada por fluxo abordagem desenvolvida por E. A. Newsholme, B. Crabtree et al. Alternativa ao MCA, do qual difere quando incorpora o conceito de reguladores parcialmente externos, cujas concentrações são parcialmente variáveis e parcialmente constantes. Teoria dos sistemas bioquímicos abordagem desenvolvida por M. A. Savageau et al. Teoria geral do controle metabólico que inclui tanto a análise do controle (MCA) como a teoria orientada por fluxo como casos especiais. Ênfase é dada na predição de como os sistemas irão se comportar quando as condições se modificam, mas do que entender os termos físicos pelos quais são controlados.

5 Fundamentos da MCA! Aplicável apenas a condições de estado estacionário (ou pseudo estado-estacionário) as concentrações do primeiro substrato e do produto final de cada caminho metabólico podem ser mantidas constante tanto pelo controle das condições ambientais ou como resultado da regulação intracelular.! Um estado estacionário estável é definido unicamente pelas atividades das enzimas catalisadoras dos passos individuais do caminho atividades das enzimas = parâmetros do sistema propriedades que são determinadas pelos valores destes parâmetros (p.ex. fluxo através do caminho metabólico ou concentração de intermediários intracelulares) = variáveis do sistema Um dos objetivos da MCA é relacionar as variáveis do sistema metabólico com os seus parâmetros

6 Coeficientes do Controle de Fluxo (FCC) A sensitividade de uma variável do sistema (fluxo) com respeito aos parâmetros do sistemas (atividades enzimáticas) pode ser determinada. As sensitividades resumem a extensão do controle do fluxo exercido pela atividade de uma enzima no caminho metabólico, i.e. como um parâmetro afeta as variáveis do sistema Tais sensitividades podem ser descritas por um conjunto de coeficientes os Coeficientes do Controle de Fluxo definidos como a mudança relativa no fluxo do estado estacionário resultante de uma alteração infinitesimal na atividade de uma enzima do caminho metabólico dividido pela mudança relativa da atividade enzimática C = E J dj de = d d ( ln J ) ( ln E)

7 Certa perturbação na atividade de uma enzima aumenta em 5% a taxa da reação isolada. Esta mesma perturbação quando incluído o sistema metabólico leva a um aumento no fluxo de 2%... É dito que o coeficiente do controle de fluxo desta enzimas é igual a 2/5 ou 0,4. Se a mesma perturbação causa um decréscimo de 10% na concentração do substrato da enzima, esta enzima tem um coeficiente do controle de concentração para este metabólito de -10/5 ou -2.

8 Coeficientes de Elasticidade A elasticidade é uma propriedade local de uma enzima isolada que expressa como sua taxa varia com a concentração de qualquer metabólito que a afeta: substrato, produto ou qualquer outro metabólito. Uma elasticidade de 0.5 com respeito ao substrato significa que um aumento de 2% na concentração de susbstrato irá aumentar em 1% a taxa da reação catalisada por esta enzima (0.5 x 2%).! elasticidades para o substrato são positivas (exceto sob condições de inibição pelo substrato);! elasticidades para o produto são negativas (exceto sob condições de inibição pelo produto);! elasticidades para ativadores são positivas e para inibidores são negativas

9 Sujando as mãos: Abordagens Experimentais Métodos para determinação dos FCCs:! métodos diretos coeficientes de controle são determinados diretamente do fluxo e as medidas de atividade seguem pequenas (mas finitas) mudanças na atividade;! métodos indiretos coeficientes de elasticidade e de controle são calculados a partir dos teoremas da MCA;! a partir de medidas nas concentrações dos metabólitos em estado transiente (i.e. entre uma perturbação e o estado estacionário), Delgado & Liao (1992a, b).

10 Métodos Diretos Métodos de Perturbação A forma óbvia de determinar os coeficientes de controle é seguir a definição dos mesmos, i.e. perturbar um passo metabólico, deixar o sistema encontrar um novo estado estacionário e; então medir a alteração na variável de interesse. Existem várias formas de perturbar a taxa de uma reação... (i) Mudança na concentração da enzima por meios genéticos técnicas de biologia molecular permitem o controle da expressão da enzima a nível genético (ex. Flint et al. (1981) e Niederberger et al. (1992) ou Fell (1992)) (ii) Titulação com enzima purificada extratos livres de células são usados no procedimento onde se considera que todas as demais enzimas do caminho metabólico (enzimas auxiliares) sao fornecidas em excesso e portanto a respectiva contribuição no controle do fluxo é reduzida (ex. Torres et al. (1986) ou Fell (1992) ) (iii) Titulação com inibidores específicos quando o fluxo resultante da titulação da atividade da enzima in vivo é mensurado, estima-se o coeficiente de resposta com relação ao inibidor (ex. Groen et al. (1982), Westerhoff & Kell (1988), Small (1993) ou Fell (1992))

11 Uso de inbidor específico Titulação com enzima

12 Cada perturbação deve afetar apenas um passo do caminho metabólico. Para fazer uma fotografia completa do controle de uma dada variável, o mesmo procedimento deve ser repetido em cada passo do sistema. Problemas associados com estas abordagens: (i) perturbações devem ser pequenas (1%) o estado estacionário muda quando as perturbações são finitas existindo erros associados a estas perturbações (quanto maior a perturbação, maior o erro). Porem, perturbações muito pequenas são difíceis de serem mensuradas usual: 10%. (ii) inibidores devem ser específicos não afetar outras reações do sistema (nem sempre se consegue preencher este requisito). (iii) taxa de reação deve mudar linearmente com a concentração da enzima, se queremos usar a concentração enzimática como parâmetro a perturbar. Os coeficientes de controle são normalmente definidos como coeficientes de resposta pois as enzimas sofrem influência de efetores externos.

13 MCA da Biossíntese de Penicilina ACVS:!sofre inibição por feedback do produto LLD-ACV!efetores da taxa de reação ATP, AMP, pirofosfato, fosfato, CoA e Mg 2+!ATP estimula a reação!amp e pirofosfato inibem a reação IPNS:!ferro dependente!sensível a variações na [OD] cinética 1a. ordem

14 Coeficientes de Elasticidade: ACVS negativo, i.e. aumento na concentração de LLD-ACV diminui a taxa de síntese deste produto e a magnitude do coeficiente de elasticidade aumenta durante a condução do processo em batelada alimentada devido ao aumento da concentração deste composto. IPNS positivo, i.e. o efeito do aumento na concentração de LLD-ACV é positivo e magnitude deste efeito diminui ao longo da batelada devido à saturação de IPNS pelo seu substrato Tempos de batelada muito longos prejudicam o processo!!!

15 Coeficientes de Controle de Fluxo: ACVS inicialmente é alto (próximo a 1) dada a baixa inibição pelo produto Conforme a [LLD-ACV] aumenta, o controle do fluxo metabólico troca de forma gradual da enzima ACVS para a enzima IPNS. Após 70 h de processo, o fluxo é controlado primariamente por IPNS. Nenhuma das duas enzimas pode ser identificada como responsável pela etapa limitante do processo. FCCs não são constantes para um dado caminho metabólico

16 Referências Metabolic Engineering Principles and Methodologies, Stephanopoulos G.N., Aristidou, A.A. & Nielsen, J., Academic Press, 1998, Cap. 11 Metabolic Control Analysis, pp