CRESCIMENTO MICROBIANO

Transcrição

1 CRESCIMENTO MICROBIANO

2 CRESCIMENTO MICROBIANO Em microbiologia crescimento geralmente é o aumento do número de células; Na maioria dos procariotos ocorre a fissão binária: crescimento e divisão.

3 CRESCIMENTO POPULACIONAL VARIAÇÃO DO NÚMERO DE CÉLULAS OU DA MASSA CELULAR POR UNIDADE DE TEMPO Durante o ciclo de divisão celular, todos os componentes estruturais de uma célula são DUPLICADOS. O intervalo em que uma célula origina duas novas é denominado GERAÇÃO o tempo necessário para que isso ocorra é denominado TEMPO DE GERAÇÃO. VARIAM DENTRE OS ORGANISMOS E CONDIÇÕES AMBIENTAIS

4 CRESCIMENTO EXPONENCIAL PADRÃO DE AUMENTO POPULACIONAL NÚMERO DE CÉLULAS É DUPLICADO A CADA PERÍODO

5 CRESCIMENTO EXPONENCIAL O crescimento exponencial caracteriza-se por apresentar inicialmente uma taxa lenta de aumento no número de células, que posteriormente é acelerada. Implicações práticas: Um produto não estéril como o leite é mantido em condições cujo crescimento microbiano é favorecido, o crescimento durante as primeiras horas (estágios iniciais de crescimento exponencial) não traz riscos à saúde - a manutenção das culturas pelo mesmo período de tempo (estágios finais de crescimento exponencial) pode ser desastrosa.

6 PARÂMETROS DE CRESCIMENTO Tratando-se bactérias, algas unicelulares e leveduras que se multiplicam por divisão binária, temos: 2 1 > 2 2 > 2 3 > 2 4 n N=N 0.2 Onde N = n microrganismos ao fim de n divisões N 0 é o número inicial O número de gerações será: n = 3,3(logN-logN 0 ) A velocidade exponencial de crescimento (R) é expressa pelo número de divisões no tempo: n R= t-t 0 A recíproca de R é o tempo de geração: 1 t- t0 G= = R n

7 PARÂMETROS DE CRESCIMENTO

8 PARÂMETROS DE CRESCIMENTO Essas equações não se aplicam a microrganismos filamentosos, assim, é mais conveniente aplicar-se uma equação mais geral, onde se considera a variação da massa (X), em função do tempo como sendo proporcional a concentração de biomassa presente: dx dt X

9 CICLO DE CRESCIMENTO A fase exponencial reflete apenas uma parte do ciclo de crescimento de uma população microbiana; O crescimento de microrganismos em um recipiente fechado (batelada) apresenta um ciclo típico com todas as fases de crescimento.

10 CICLO DE CRESCIMENTO

11 Fase Lag Período de adaptação da cultura Mudança de meio, preparação do complexo enzimático Reparação das células com danos.

12 Fase exponencial Fase mais saudável das células onde todas estão se dividindo. A maioria dos microrganismos unicelulares apresentam essa fase, mas as velocidades de crescimento são bastante variáveis: - Procarióticos crescem mais rapidamente que os eucarióticos - Eucarióticos menores crescem mais rapidamente que os maiores

13 Fase estacionária: Num sistema fechado (tubo, frasco ou biorreator) o crescimento exponencial não pode ocorrer indefinidamente. Ocorre a limitação por depleção de nutrientes e acúmulo de metabólitos. Divisão = morte crescimento líquido nulo Ainda pode ocorrer: catabolismo e produção de metabólitos secundários

14 Fase de morte (declínio): A manutenção de uma cultura no estado estacionário por longo tempo conduz as células ao processo de morte. - A morte celular é acompanhada da lise celular

15 CULTIVO CONTÍNUO Técnica muito usada nos processos industriais de obtenção de produtos microbiológicos; Manutenção das células em fase log ou estacionária; Utilizam-se fermentadores ou quimiostatos - crescimento em equilíbrio dinâmico; Controle da densidade populacional e da taxa de crescimento, pela concentração do nutriente limitante (fonte de C ou N) e pela taxa de fluxo (taxa de diluição); Em baixas concentrações do nutriente limitante, a taxa de crescimento é proporcional à concentração do nutriente (que é virtualmente zero).

16 CULTIVO CONTÍNUO - QUIMIOSTATO Entrada de meio fresco Regulador de fluxo Espaço não preenchido Cuba Cultura Saída Efluente

17 MEDIDAS DE CRESCIMENTO MICROBIANO Vários métodos podem ser empregados na contagem do número total de células ou na mensuração da massa celular adaptáveis a diferentes organismos ou situações. AVALIAÇÃO DIRETA contagem de células (microscópio) ou viáveis, filtração e técnica do número mais provável. AVALIAÇÃO INDIRETA turbidez, atividade metabólica e peso seco.

18 CONTAGEM DIRETA NO MICROSCÓPIO Câmara de Petroff-Hausser Câmara de Neubauer

19 CONTAGEM DIRETA NO MICROSCÓPIO Coloração com azul de metileno para evidenciar células viáveis de leveduras Células azuis estão mortas; células sem coloração são células vivas

20 QUANTIFICAÇÃO MICORRIZA

21 CONTAGEM DE VIÁVEIS

22 DILUIÇÃO DECIMAL PARA PLAQUEAMENTO

23 CONTAGEM DE VIÁVEIS ERROS COMUNS GRANDE ANOMALIA DA CONTAGEM EM PLACA

24 FILTRAÇÃO

25 FILTRAÇÃO

26 MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL QUANTO MAIOR O NÚMERO DE MICRORGANISMOS EM UMA AMOSTRA MAIOR SERÁ O NÚMERO DE DILUIÇÕES PARA ELIMINAR TOTALMENTE O CRESCIMENTO EM TUBOS CONTENDO MEIO DE CULTURA

27 CONTAGEM DIRETA ELETRÔNICA

28 TURBIDEZ As células dispersam a luz e quanto mais células mais turvo é o meio. Pode ser medida em um espectrofotômetro ou fotômetro.

29 CURVA PADRÃO Para os organismos unicelulares, as unidades fotométricas ou densidades óticas (DO) são proporcionais (dentro de certos limites) ao número de células. A curva padrão relaciona medidas diretas de número (contagem microscópica ou de viáveis) ou de massa (peso seco) de células, com medidas de turbidez.

30 ATIVIDADE METABÓLICA Este método considera que a quantidade de um certo produto metabólico, como ácido ou CO 2, pode ser uma relação direta do número de células ou massa seca presente.

31 PESO SECO É a melhor forma de se analisar o crescimento de FUNGOS FILAMENTOSOS O fungo é removido do meio de cultura por filtração, para eliminar outros materiais, seco em dessecador para pesagem.

32 EFEITOS AMBIENTAIS NO CRESCIMENTO MICROBIANO As atividades microbianas são intensamente afetadas pelas condições químicas e físicas de seus ambientes; O entendimento das influências ambientais ajuda a explicar a distribuição dos microrganismos na natureza, tornando possível o desenvolvimento de método para o controle ou otimização das atividades microbianas; 4 fatores principais: - temperatura - ph - disponibilidade de água - oxigênio

33 EFEITO DA TEMPERATURA Temperaturas cardeais dos microrganismos

34 CLASSES TÉRMICAS DE ORGANISMOS

35 INFLUÊNCIA DE PH A maioria dos organismos tem uma faixa de ph que varia de duas a três unidades; A faixa de ph observada na maioria dos ambientes é de 5 a 9 os microrganismos mais comuns são os adaptados a esses valores. Fungos, de uma maneira geral, são mais tolerantes a acidez.

36 PRESSÃO OSMÓTICA

37 OXIGÊNIO E CRESCIMENTO MICROBIANO Meio gelatinoso com indicador redox: - rosa quando oxidado - incolor quando reduzido Aeróbio Anaeróbio Facultativo Microaerófilo Anaeróbio aerotolerante Classes de organismos, em relação à tensão de oxigênio

38 OXIGÊNIO E CRESCIMENTO MICROBIANO

39 FONTES NUTRICIONAIS Macronutrientes: - Necessários em grande quantidade; - Tem papel importante na estrutura e metabolismo. Micronutrientes: - Necessários em quantidades mínimas; - Funções enzimáticas e estruturais das biomoléculas.

40 COMPONENTES CELULARES Fonte de Carbono: - Compostos orgânicos (microrganismos heterotróficos): carboidratos lipídeos proteínas - Dióxido de carbono (microrganismos autotróficos): É a forma mais oxidada do carbono, assim a fonte de energia deve vir da luz ou compostos inorgânicos.

41 COMPONENTES CELULARES Fonte de Nitrogênio: É elemento necessário em maior quantidade depois do carbono, cerca de 12 %. (constituinte das proteínas, ácidos nucléicos, etc.) - moléculas orgânicas (aminoácidos, peptídeos) - moléculas inorgânicas (NH 3, NO 3-, N 2 ) A capacidade de algumas bactérias em utilizar o nitrogênio atmosférico (FBN) é de fundamental importância para a vida de todos os seres.

42 COMPONENTES CELULARES Hidrogênio: - Principal elemento dos compostos orgânicos e de diversos inorgânicos (água, sais e gases) Funções: - Manutenção do ph - Formação de ligações de H entre moléculas - Fonte de energia nas reações de oxi-redução na respiração

43 COMPONENTES CELULARES Outros macronutrientes: P S Síntese de ácidos nucléicos, ATP Estabilidade de aminoácidos, componente de vitaminas K Atividade de enzimas Mg Estabilidade dos ribossomos Ca Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de endósporos Na Requerido em maior quantidade por microrganismos marinhos. Bactérias halofílicas extremas não crescem com menos de 15% de sal. Fe Papel-chave na respiração, componente dos citocromos e das proteínas envolvidas no transporte de elétrons.

44 COMPONENTES CELULARES MICRONUTRIENTES Quantidades muito pequenas (traços) necessários na composição de um meio de cultura: Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B Exercem função estrutural em várias enzimas (ativação) - Nem sempre sua adição é necessária - Meios sintéticos com compostos de alto grau de pureza e água ultra pura podem apresentar deficiências desses elementos.

45 MEIOS DE CULTURA Soluções de nutrientes para promover o crescimento de microrganismos; Não existe um meio de cultura universal; Existem vários tipos de meios para diversas finalidades. Para obter sucesso no cultivo de microrganismos é necessário o conhecimento de suas exigências nutricionais, para que os nutrientes sejam fornecidos na forma e proporção adequadas. Quimicamente definidos (sais, compostos orgânicos purificados, água) Complexos (hidrolisados de carne e soja, extratos de levedura, sangue, soro, leite, solo, rúmen bovino)

46 MEIOS DE CULTURA Embora não existam meios específicos para todos os microrganismos, existem centenas de formulações para inúmeras finalidades. Alguns são meios gerais: permitem o crescimento de muitas espécies Outros são meios específicos: servem para identificação de espécies, por ex.

47 MEIOS ESPECIAIS Meios para anaeróbios: adição de agentes redutores (tioglicolato de sódio) Meios seletivos: favorece o crescimento de um tipo particular ou suprime outros. Ex. meio ágar verde brilhante. Meios diferenciais: para diferenciar microrganismos dentro de uma cultura mista. Ex. meio com sangue para distinguir as hemolíticas. Meios seletivos/diferenciais: Ex. Meio McConkey que contém sais de bile e cristal violeta. Meios de enriquecimento: se objetiva o aumento de uma determinada espécie sem inibir as demais. Ex. isolar bactérias que oxidam fenol, fornecendo fenol como única fonte de carbono.

48 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.M., PARKER, J. Microbiologia de Brock. São Paulo: Prentice Hall, PELCZAR, M.J., CHAN, E.C.S., KRIEG, N.R. Microbiologia. São Paulo: Makron Books, volumes 1 e 2. TORTORA, G.J., FUNKE, B.R., CASE, C.L. Microbiologia. Porto Alegre: Artmed, 2000.