PRODUÇÃO DE LIPASE DE Geotrichum candidum POR FERMENTAÇÃO SUBMERSA UTILIZANDO SUBPRODUTOS DO PROCESSAMENTO DO MILHO

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1 PRODUÇÃO DE LIPASE DE Geotrichum candidum POR FERMENTAÇÃO SUBMERSA UTILIZANDO SUBPRODUTOS DO PROCESSAMENTO DO MILHO Edson Ribeiro 1, Guilherme S. Silva 2, Eliana S. Kamimura 2, Elizama Aguiar-Oliveira 3*, Rafael R. Maldonado 1,4 1 Faculdade Municipal Professor Franco Montoro (FMPFM) 2 Universidade de São Paulo (USP), Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos (FZEA) 3 Universidade Federal da Bahia (UFBA), campus Anísio Teixeira (CAT), Instituto Multidisciplinar em Saúde (IMS) 4 Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Colégio Técnico de Campinas (COTUCA) * contato: elizamaguiar@yahoo.com.br RESUMO A produção microbiológica de lipase é de grande interesse industrial sendo a redução de custos e o reaproveitamento de resíduos e subprodutos agroindustriais prática frequentemente incentivada. O objetivo desse estudo foi avaliar a produção de lipase por G. candidum NRRLY-552em fermentação submersa utilizando subprodutos do processamento do milho: água de maceração de milho (AMM) e torta de milho (TM). AMM foi empregada a 6% (m/v) como fonte de nitrogênio e TM e óleo de milho (OM) foram avaliados como indutores da produção de lipase a 10 e 1% (m/v), respectivamente. As condições de cultivo empregadas foram ph = 7,0, 30 C e 200 rpm. O emprego de inóculo líquido, ao invés de sólido, foi mais favorável resultando em produtividades máximas de 1,27 e 0,38 U/mL.h (24h) com OM e TM, respectivamente. Os resultados mostraram que o OM é melhor indutor para produção de lipase, mas TM apresenta bom potencial, visto que apresenta menor custo que OM, sendo necessário estudos mais detalhados sobre sua aplicação. 1. INTRODUÇÃO O estudo das lipases é bastante documentado na literatura devido ao grande número de aplicações que elas podem apresentar frente a sua capacidade de hidrolisar, de forma reversível, triacilgliceróis além de funcionar como catalisadores para processos de esterificação, interesterificação e transesterficação (Hartzinikolaou et al., 1996; Maldonado, 2012). As lipases podem ser obtidas de diferentes fontes, mas os fungos tendem a ser a opção mais viável para produção em grande escala por geralmente produzirem lipases extracelulares; dentre estes, Geotrichum sp. e G. candidum tem sido avaliados com sucesso para a produção de lipases (Asses et al., 2009; Burkert et al., 2005;

2 Maldonado et al., 2014, 2012A e 2012B; Yan e Yan, 2008). Resíduos ou subprodutos agroindustriais vem sendo intensamente investigados para a produção de lipases como por exemplos subprodutos provenientes do processamento de milho, como a água de maceração de milho (Maldonado et al., 2014A, 2014B e 2012B, Kamimura et al., 1999) e a torta de milho (Fernandes, 2007; Melquides e Maldonado, 2014).Outro aspecto importante na produção das lipases é a fonte de lipídeos utilizada como indutor da produção, como exemplo, o óleo de soja (Burket et al., 2005; Maldonado et al., 2014A; Rigo et al., 2010), óleo de oliva (Burket et al., 2004; Cordova et al., 1998; Goldbeck e Maugeri, 2013; Kamimura et al., 1999), óleo de amendoim (Yang et al., 2005), águas residuárias (Asses et al., 2009; Navarro et al., 2011), pinhão manso (Mahanta et al., 2008). Entretanto, óleo de milho tem sido pouco mencionado até o momento. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi avaliar a produção de lipase por G. candidum NRRLY-552 sendo cultivado em fermentação do tipo submersa utilizando água de maceração de milho (AMM) como principal fonte de nitrogênio e avaliando o uso de óleo (OM) e torta de milho (TM) como indutores para a produção de lipase extracelular. O emprego de substratos alternativos em bioprocessos é de grande importância, pois reduz consideravelmente o custo do processo favorecendo assim a potencialidade da aplicação tecnológica. 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1. Produção de lipase Geotrichum candidum NRRLY-552 foi cultivado em placas de Petri contendo meio sólido Yeast Malt por 72 horas a 30 C. Após esse período uma área circular de 1 cm 2 foi recortada assepticamente do meio sólido contendo o micro-organismo e empregada como inóculo sólido (Maldonado et al., 2014A). O primeiro ensaio realizado foi feito com a inoculação do micro-organismo diretamente nos meios de fermentação. Foram utilizadas duas condições: Meio A1 6% (m/v) de água de maceração de milho (AMM) e 0,5% (m/v) de óleo de milho (OM) e Meio B1 6% (m/v) de AMM e 5% (m/v) de torta de milho (TM). A concentração de AMM e OM foram definidas de acordo com os valores utilizados por Maldonado et al. (2014) e a de TM foi definida de forma que a concentração de lipídeos presente na torta ofertasse uma concentração de lipídeos semelhante ao do ensaio utilizando OM. O cultivo foi realizado em Erlenmeyers de 250 ml com volume útil de 50 ml de meio, com ph ajustado para 7,0 com solução de NaOH 50% (m/m). As fermentações foram realizadas a 30 C e 200 rpm de agitação. A partir dos resultados obtidos, realizou-se um segundo experimento, nas mesmas condições, aumentando as concentrações de OM para 1,0% (m/v) (Meio A2) e de TM para 10% (m/v) (Meio B2). Em um terceiro ensaio, foram mantidas as condições do segundo ensaio, mas foi adicionada uma etapa de inóculo líquido. Nesse caso, após o crescimento do micro-organismo, o inóculo sólido (1 cm 2 ) foi transferido para 50 ml de meio contendo 6% (m/v) de AMM e 1,0% de OM com ph = 7,0 sendo incubado por 24 horas a 30 C e 200 rpm. Após esse período, alíquotas de 5 ml do meio deste inóculo líquido foram transferidos para os meios de fermentação a 10% (v/v).

3 A AMM utilizada neste trabalho continha 53% (m/v) de proteína, 22% (m/v) de ácido láctico e 0,8% (m/v) de açúcares redutores e a TM continha 18,2% (m/v) de proteína; 8,4% (m/v) de óleo e 10% (m/v) de umidade. Todos os ensaios foram realizados em triplicatas e as amostras das fermentações foram coletadas em 24, 48 e 72 horas para determinação da atividade de lipase Determinação da atividade de lipase A atividade de lipase foi determinada pelo método titulométrico conforme aplicado por Maldonado et al. (2014A) em que parte-se de uma emulsão de goma arábica e óleo de oliva e os ácidos graxos liberados são titulados com solução de NaOH e fenolftaleína como indicador; a concentração de ácidos graxos liberados foi determinada através de uma curva padrão de ácido oléico. O valor da atividade enzimática foi expresso em U/mL, sendo que uma unidade (U) é definida como a quantidade de enzima que libera 1 µmol de ácido graxo por minuto de reação (Macedo e Pastore, 1997). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados do primeiro experimento para avaliação da produção de lipase por Geotrichum candidum utilizando os Meios A1 e B1 (vide Item 2.1) apresentaram valores de atividade lipolítica muito baixos e apenas detectados em 48h com valores de 1,12 U/mL (Meio A1) e 0,60 U/mL (Meio B1). Dessa forma, decidiu-se realizar um segundo experimento dobrando as concentrações de OM (Meio A2) e de TM (Meio B2). Os resultados obtidos para o segundo ensaio estão apresentados na Tabela 1. Tabela 1. Produção de lipase por Geotrichum candidum NRRLY-552 utilizando água de maceração de milho (AMM), torta de milho (TM) ou óleo de milho (OM) a 30 C, ph = 7,0 e 200 rpm. Como inóculos, foram empregados 1 cm 2 de corte de ágar YM de cultivo diretamente no meio de fermentação (inóculo sólido) ou em etapa intercalada em meio líquido (inóculo líquido) tendo sido neste caso utilizada a taxa de inoculagem de 10% (v/v). Meio de fermentação (% m/v) Meio A2: AMM (6,0%) + OM (1,0%) Meio B2: AMM (6,0%) + TM (10,0%) * Produtividades (U/mL.h) Atividade lipolítica (U/mL) Inóculo sólido Inóculo líquido 24h 48h a 24h b 48h 72h 3,42 ± 0,22 8,20 ± 0,35 30,39 ± 1,97 31,30 ± 3,28 26,80 ± 1,12 (0,142) * (0,171) * (1,266) * (0,652) * (0,372) * 1,04 ± 0,19 2,40 ± 0,82 9,12 ± 1,04 10,48 ± 0,20 9,12 ± 0,20 (0,043) * (0,050) * (0,380) * (0,218) * (0,127) *

4 De acordo com os resultados obtidos do segundo experimento (Tabela 1), verificou-se um efeito positivo do aumento das concentrações de OM e TM visto que houve um aumento na produção de lipase em 8 vezes para o Meio A2 e 4 vezes para o Meio B2. A utilização da TM alterou as características do meio de fermentação, uma vez que esta matéria-prima é sólida e o aumento da sua quantidade faz com que o meio fique menos fluido, o que compromete a agitação do sistema durante a fermentação e consequentemente resulta em uma menor produção da enzima. TM apresentou, portanto bom potencial para a produção de lipases de G. candidum, mas requer maiores estudos quanto a seu uso em fermentação líquida ou semi-sólida. Em estudo prévio, por exemplo, utilizando TM suplementada com cloreto de amônio e OM na produção de lipase por G. candidum foi obtida uma maior produção da enzima, de 29 U/g extrato seco após 48 horas de fermentação (Melquides e Maldonado, 2014) o que confirma a potencialidade da TM como substrato alternativo. Os resultados obtidos nesta etapa (Tabela 1), entretanto, foram inferiores aos obtidos por outros autores (Burket et al., 2005, Maldonado et al., 2014A e 2012C) que utilizaram o mesmo microorganismo com diferentes substratos e cujos valores variaram de 16 e 24 U/mL após 48 horas de fermentação. Sendo assim, decidiu-se incluir uma etapa de inóculo líquido ou pré-fermentação para a produção de lipase, pois os autores referidos já haviam verificado que as condições de inóculo podem alterar significativamente a produção da enzima. Os resultados para o terceiro experimento de produção de lipase por G.candidum utilizando AMM e TM ou OM acrescida de uma etapa de inóculo líquido também estão apresentados na Tabela 1 e deles é possível verificar que a introdução da etapa de inóculo líquido aumentou de forma considerável a atividade máxima de lipase obtida. Com o meio utilizando OM o aumento foi de 3,8 vezes enquanto que com a utilização da TM o aumento chegou a 4,3 vezes. Isso demonstra que uma etapa de inóculo líquido é fundamental para aumentar a produção da lipase de G. candidum. Além disso, o resultado obtido utilizando OM como indutor (31,3 U/mL) foi cerca de 50% maior do que o resultado obtido com óleo de soja como indutor (21 U/mL), ambos em 48h e com o mesmo microorganismo em condições similares de fermentação (Maldonado et al., 2014). Entretanto, ao analisar os valores obtidos (Tabela 1), expressos como produtividades (U/mL.h), foi possível ainda observar que os melhores resultados foram obtidos com 24 h com os inóculos líquidos, condições estas que resultaram em produtividades cerca de 7 vezes maiores do que as obtidas com os inóculos sólidos em seu ponto de máxima produtividade (48 h). 4. CONCLUSÃO Com os resultados obtidos foi possível concluir que OM e TM são bons indutores para produção de lipase de G. candidum por fermentação submersa utilizando AMM como fonte de nitrogênio. No entanto, devido às características da TM, seu desempenho foi menor, indicando a necessidade de estudos complementares para sua melhor utilização, especialmente porque seu custo é bem menor que o do OM. Em conclusão, as modificações realizadas ao longo do estudo (aumento da concentração do indutor e introdução de uma etapa de inóculo líquido) resultaram em um aumento

5 significativo nos valores máximos de atividade de lipase para ambos os indutores testados: 28 vezes com o OM e 17 vezes com a TM, em comparação com a condição experimental inicial. O emprego do inóculo líquido resultou ainda em valores de produtividade máximas cerca de 7 vezes maiores que do que com o inóculo sólido. 5. NOMENCLATURA AMM: água de maceração de milho; OM: óleo de milho; TM: torta de milho; U: unidade de atividade enzimática. 6. REFERÊNCIAS Asses, N., Ayed, L., Bouallagui, H., Rejeb, I.B., Gargouri, M., Hamdi, M., Use of Geotrichum candidum for olive mill wastewater treatment in submerged and static culture. Bioresour Technol. 100(7), Burket, J.F.M., Maldonado, R.R., Maugeri, F., Rodrigues, M.I., 2005.Comparison of lipase production by Geotrichum candidum in stirring and airlift fermenters. J Chem Technol Biotechnol. 80(1), Burket, J.F.M.,Maugeri, F., Rodrigues, M.I., 2004.Optimization of extracellular lipase production by Geotrichum sp. using factorial design. Bioresour Technol. 91, Cordova, J., Nemmaqui, M., Ismaili-Alaoui, M., Morin, A., Roussos, S; Raimbault, M., Benjulali, B., Lipase production by solid state fermentation of olive cake and sugar cane bagasse. J Mol Catal B: Enzym. 5, Fernandes, M.L.M., Produção de lipases por fermentação no estado sólido e sua utilização em biocatálise. Tese de Doutorado, Universidade Federal do Paraná. Goldbeck, R.,Maugeri Filho, F., Screening, characterization, and biocatalytic capacity of lipases producing wild yeasts from Brazil biomes. Food Sci Biotechnol. 22(1), Hatzinikolaou, D.G., Macris, J.B.,Christakopoulos, P., Kekos, D., Kolisis, F.N., Production and partial characterization of lipase from Aspergillus niger. Biotechnol Lett. 18(5), Kamimura, E.S., Mendieta, O., Sato, H.H., Pastore, G., Maugeri, F., 1999.Production of lipase from Geotrichum sp. and adsorption studies on affinity resin. Braz J Chem Eng. 16(2), Macedo, G., Pastore, G.M., Lipases microbianas na produção de ésteres formadores de aroma. Ciênc Tecnol Aliment. 17(2),

6 Mahanta, N., Gupta, A.,Khare, S.K., Production of protease and lipase by solvente tolerant Pseudomonas aeruginosa Pse A in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed and cake as substrate. Bioresour Technol. 99, Maldonado, R.R., Aguiar-Oliveira, E.,Pozza, E.L., Costa,F.A.A.,Maugeri Filho, F., Rodrigues, M.I., 2014A.Production of lipase from Geotrichum candidum using corn steep liquor in different bioreactors. J Am Oil Chem Soc. 91, Maldonado, R.R., Macedo, G.A., Rodrigues, M.I., 2014B. Lipase production using microorganisms from different agro-industrial by-products. Int J Appl Sci Technol. 4(1), Maldonado, R.R., Aplicação da lipase de Geotrichum candidum para biocatálise de óleos vegetais com vistas à produção de biodiesel. Tese de Doutorado, Universidade Estadual de Campinas. Maldonado, R.R.,Panciera, A.L.; Macedo, G.A.,Mazutti, M.A.,Maugeri, F., Rodrigues, M.I., 2012A.Improvement of lipase production from Geotrichum sp. in shaken flasks. Chem Biochem Eng Q. 18, Maldonado, R.R.,Burket, J.F.M.,Mazutti, M.A.,Maugeri, F., Rodrigues, M.I., 2012B.Evaluation of lipase production by Geotrichum candidum in shaken flasks and bench-scale stirred bioreactor using different impellers. Biocatal Agric Biotech. 1(2), Melquides, S., Maldonado, R.R., Fermentação semi-sólida para produção de lipase de Geotrichum candidum utilizando torta de milho. Trabalho de Conclusão de Curso em Engenharia Química, Faculdade Municipal Professor Franco Montoro, Mogi Guaçu - SP. Navarro, A.S.,Gea, T.,Barrena, R., Sánchez, A., 2011.Production of lipases by solid state fermentation using vegetable oil-refining wastes. Bioresour Technol. 102(21), Rigo, E.,Ninow, J.L., DiLuccio, M., Oliveira, J.V.,Polloni, A.E.,Remonatto, D.,Arbter, F.,Vardanega, R., Oliveira, D.,Treichel, H., 2010.Lipase production by solid fermentation of soybean meal with different supplements. LWT - Food Sci Technol. 43(7), Yan, J.-Y., Yan, Y.-J., Optimization for producing cell-bound lipase from Geotrichumsp and synthesis of methyl oleate in microaqueous solvent. Appl Biochem Biotechnol. 78, Yang, X., Wang, B., Cui, F., Tan, T., Production of lipase by repeated batch fermentation with immobilized Rhizopus arrhizus. Process Biochem. 40(6),