FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO DE DIFERENTES RESÍDUOS PARA A OBTENÇÃO DE LIPASE MICROBIANA

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1 81 ISSN FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO DE DIFERENTES RESÍDUOS PARA A OBTENÇÃO DE LIPASE MICROBIANA Érica Mara Dantas 1 Luciana Cristina Lins de Aquino 2 RESUMO A fermentação em estado sólido destaca-se no aproveitamento de resíduos agroindustriais para a síntese de diversos compostos de interesse industrial e de elevado valor agregado. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de resíduos agroindustriais (torta de mamona, torta de babaçu, sementes de abóbora, casca de abacate e borra de café) para a obtenção de lipase microbiana utilizando o microrganismo Aspergillus niger. Nos experimentos fermentativos estudou-se a influência do teor de agua do substrato (35 a 65%b.u.) e avaliou-se a cinética de produção de lipase. O extrato enzimático obtido nos processos foi avaliado quanto ao efeito do ph (entre 2,0 e 8,0) e da temperatura (entre 30 e 70 o C) na atividade lipolítica. Maior produção de lipase (24,6 U g -1 ) foi obtida quando utilizado como fonte de carbono a torta de babaçu contendo um teor de água de 45%b.u. durante 168 horas de fermentação. A lipase obtida a partir deste resíduo obteve maior atividade enzimática (3278 U g -1 ) em ph 2,0 e temperatura de 30 C. Através deste trabalho verificou-se que os resíduos: sementes de abóbora, cascas de abacate, torta de babaçu, torta de mamona e borra de café demonstraram potencial para a obtenção de lipase microbiana acídica. Palavras-chave: Lipase, Fermentação em estado sólido, Resíduo agroindustrial. SOLID STATE FERMENTATION OF DIFFERENT RESIDUES TO OBTAIN MICROBIAL LIPASE ABSTRACT The solid state fermentation have been used agroindustrial residues for the synthesis of various high value compounds. The objective of this study was to evaluate the potential of agroindustrial residues (castor oil cake, babassu oil cake, pumpkin seeds, avocado rind and coffee grounds) to obtain microbial lipase using the microorganism Aspergillus niger. In the fermentations was evaluated the effect of moisture content in the substrate (35 to 65% w.b.) and the kinetics of lipase production. It was evaluated the effect of ph (between 2.0 and 8.0) and temperature (between 30 and 70 C) on the hydrolytic activity of enzymatic crude extract. The higher production of lipase (24.6 U g -1 ) was obtained when used babassu cake, as a carbon source, containing 45% w.b. of moisture content for 168 hours of fermentation. A lipase presented higher enzymatic activity (3278 U g -1 ) at ph 2.0 and temperature of 30 C. Through this work it was found that the waste: pumpkin seeds, avocado rind, babassu oil cake, castor bean cake and coffee grounds have shown potential for obtaining acidic microbial lipase. Keywords : Lipase, Solid state fermentation, Agroindustrial residue. Protocolo de 12/09/ Graduado em Engenharia de Alimentos, Universidade Federal de Sergipe, Av. Marechal Rondon, s/n, Jardim Rosa Elze, CEP , São Cristóvão, Se. em_cv@hotmail.com 2 Professora Doutora do Curso de Engenharia de Alimentos, Universidade Federal de Sergipe, Av. Marechal Rondon, s/n, Jardim Rosa Elze, CEP , São Cristóvão, Se. aquinoluciana@hotmail.com

2 82 Fermentação em estado sólido de diferentes resíduos para a obtenção de lípase microbiana Dantas &Aquino INTRODUÇÃO As atividades agropecuárias e de processamento de produtos agropecuários têm proporcionado sérios problemas de poluição no solo, em águas superficiais e em águas subterrâneas. Os resíduos sólidos de agroindústrias (bagaços, tortas, restos de frutas e hortaliças, etc.) são provenientes de usinas sucro-alcooleiras, matadouros, indústrias do processamento de carnes (vísceras e carcaça de animais), frutas e hortaliças (bagaço, tortas, refugo e restos), indústria da celulose e papel (resíduos da madeira, lodo do processo de produção e do tratamento de águas residuárias), curtumes (aparas de couro e lodo do processo e tratamento de águas residuárias) e outros. Muitos frutos comestíveis são processados para fabricação de sucos naturais, sucos concentrados, doces em conserva, polpas e extratos, os quais possuem sementes que são, muitas vezes, descartadas e poderiam ser utilizadas para minimizar o desperdício de alimentos (Vargas, 2004). O descarte de resíduos representa um crescente problema devido ao aumento da produção. Os maiores impactos ambientais provocados por resíduos sólidos orgânicos são decorrentes da fermentação do material, podendo ocasionar a formação de ácidos orgânicos ( chorume líquido de elevada DBO formado com a degradação do material orgânico e a lixiviação de substâncias tóxicas) com geração de maus odores e diminuição do oxigênio dissolvido em águas superficiais (Graminha et al., 2008). Devido a quantidade de nutrientes disponíveis nos resíduos sólidos agroindustriais estes podem ser convertidos em produtos comerciais ou matérias-primas para processos secundários. Neste contexto a fermentação em estado sólido (FES) desempenha um papel de destaque no aproveitamento de resíduos sólidos visando a síntese de diversos compostos de alto valor agregado e de grande interesse industrial. A FES é aplicada para produção de alimentos, biopesticidas, e substâncias químicas diversas. O grande potencial é principalmente na produção de enzimas através de fungos filamentosos, os quais têm recebido a maioria das atenções nas pesquisas, pois apresentam capacidade de crescimento em baixos níveis de água (Couto e Sanroman, 2006; Rodriguez et al., 2006; Pinheiro, 2006; Graminha et al., 2008; Sun e Xu, 2008 ). Recentemente alguns pesquisadores utilizaram resíduos de alimentos provenientes de restaurantes para a produção de glicoamilases microbianas (Wang et al., 2008). Resíduos provenientes da produção de biodiesel, tais como torta de pinhão manso e de mamona também tem sido aproveitada para a obtenção de lipases e proteases microbianas (Mahatan et al., 2008; Godoy et al., 2009). As lipases (triglicerol acil-hidrolases, E.C ), são enzimas de origem animal, vegetal ou microbiana, definidas como hidrolases de ésteres contendo ácidos graxos de cadeia longa, saturados ou insaturados, com doze ou mais átomos de carbono. Dependendo da fonte, podem ter massa molecular variando entre 20 a 75 kda, atividade enzimática em phs entre 4,0 a 9,0 e em temperaturas variando desde a ambiente até 70 C (Coelho et al., 2001). As lipases microbianas constituem um importante grupo de enzimas biotecnológicamente valiosas, principalmente, pela versatilidade de suas propriedades e fácil produção de massa. Essas enzimas são diversificadas na suas propriedades enzimáticas e especificidade a substratos tornando-se muito atrativas para aplicações industriais na obtenção de vários produtos tais como: alimentos, detergentes, produtos farmacêuticos, cosméticos, produtos têxteis e fábricas de papel (Sharma et al., 2001; Pelizer et al., 2007). Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o potencial de vários resíduos agroindustriais para a obtenção de lipase microbiana através de fermentação em estado sólido (FES) utilizando o microrganismo Aspergillus niger MATERIAIS E MÉTODOS O microrganismo Aspergillus niger foi adquirido da coleção de culturas do Instituto Oswaldo Cruz (Rio de Janeiro, Brasil), mantido sob refrigeração (4 ºC) em tubos de ensaio inclinados contendo meio BDA (ágar batata dextrose). Os resíduos utilizados foram: sementes de abóbora (35% de lipídeos), cascas de abacate (11% de lipídeos), torta de babaçu (2,6% de lipídeos), torta de mamona (0,6% de lipídeos) e borra de café (15% de lipídeos). Estes foram secados em estufa a 80 ºC por 24 horas, posteriormente triturados e armazenados até sua utilização. As fermentações foram realizadas em placas de petri contendo os resíduos (100 g) e 1 ml de suspensão de esporos (7,2 x 10 6 células ml -1 ), mantidos à temperatura em torno de 30 C. Inicialmente para avaliar a influência do teor de água na produção da enzima lipase realizou-se experimentos com cada resíduo

3 Fermentação em estado sólido de diferentes resíduos para a obtenção de lípase microbiana Dantas &Aquino 83 contendo teores de água de 35%, 45%, 55% e 65% b.u. durante 96 horas de fermentação. A enzima produzida foi extraída com água destilada, centrifugada durante 10 min e o extrato bruto enzimático (EBE) foi utilizado para a determinação da atividade enzimática. A cinética de produção de lipase foi realizada através de fermentações utilizando cada resíduo no teor de água pré-determinado. De tempos em tempos retirou-se uma amostra do material com água destilada e determinou-se a atividade enzimática. O extrato bruto enzimático (EBE) obtido nestes processos foi utilizado para os experimentos subseqüentes de caracterização bioquímica. A determinação da atividade enzimática foi realizada através da mistura de 1 ml do extrato bruto enzimático, 1 g de óleo de oliva e 4 ml tampão fosfato de sódio (ph 6,0, 50 mm), mantendo-se sob agitação à 130 rpm, temperatura de 30ºC durante 60 min. A reação foi paralisada pela adição 15 ml de acetona:etanol (1:1 em volume) e a atividade foi medida pela titulação dos ácidos graxos liberados com solução de KOH 50mM usando fenolftaleína como indicador. Um branco contendo o mesmo meio reacional sem o extrato enzimático foi titulado para a determinação da quantidade pré-existente de ácidos graxos livres no substrato empregado. A atividade enzimática foi calculada segundo a Equação 1 (Pinheiro et. al., 2006). [( Va Vb) M 1000 Vd ] Vc t U = m (1) Onde: U - Atividade enzimática da lipase (Ua g -1 ); Va- Volume final de KOH gasto para titular apenas os ácidos graxos liberados do óleo de oliva, após a reação de transesterificação enzimática usando o extrato bruto enzimático (ml); Vb- Volume de KOH gasto para titular os ácidos graxos pré existentes encontrados no óleo de oliva (0,2 ml); M - Concentração da solução de KOH utilizada na titulação (M); t - tempo de reação (min); Vc - Volume de óleo de oliva utilizado (ml); Vd- Volume de solução de extração (ml); m - Massa do substrato (g). Para avaliar a influência do ph na atividade da enzima, preparou-se soluções contendo o extrato bruto enzimático, óleo de oliva comercial e tampões na concentração de 100 mm, em diferentes valores de ph (2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0 e 8,0). As soluções foram mantidas à temperatura de aproximadamente 30 C, sob agitação (130 rpm), durante 60 min e a atividade enzimática foi calculada. Para avaliar o efeito da temperatura, a solução contendo extrato bruto enzimático (EBE), óleo de oliva e tampão (onde se obteve maior atividade lipolítica) foi mantida sob agitação em temperaturas de 30 C; 40 C; 50 C; 60 C e 70 C durante 60 min. A atividade enzimática foi determinada como descrito anteriormente. RESULTADOS E DISCUSSÃO Inicialmente avaliou-se a influência do teor de água dos substratos, entre 35% e 65%, na produção de lipase através da FES. O teor de água é um fator bastante significativo nas propriedades físicas do substrato. Elevado teor de água causa a diminuição da porosidade do substrato, diminuindo assim a troca de gases. Por outro lado baixo teor de água pode acarretar na diminuição do crescimento microbiano e conseqüente menor produção de enzima (Mahanta et al., 2008). Os resultados obtidos estão apresentados na Figura 1. O teor de água dos substratos influenciou de maneira significativa a atividade hidrolítica do EBE ao longo da fermentação. Foi verificado que houve maior produção de lipase quando empregado cascas de abacate (10 U g -1 ) e sementes de abóbora (24 U g -1 ) com teor de água de 35% e torta de babaçu (25 U g -1 ) e borra de café (13 U g -1 ) com teor de água de 45%. Quando utilizado torta de mamona como substrato obteve-se máxima atividade enzimática (19 U g -1 ) nos resíduos contendo teor de água de 35% e 45% b.u.. A cinética de produção de enzima foi verificada durante a fermentação dos resíduos cascas de abacate, torta de babaçu e torta de mamona contendo teor de água de 35% b.u.; e sementes de abóbora e borra de café contendo teor de água de 45% b.u.. Os resultados estão encontram-se na Figura 2. As fermentações dos resíduos foram conduzidas até ser observado a queda ou estabilidade da atividade hidrolítica no EBE. No processo fermentativo utilizando torta de mamona obteve-se máxima atividade enzimática em 96 horas de fermentação (23 U g -1 ). Nas fermentações com cascas de abacate e sementes de abóbora obteve-se máxima atividade enzimática de 15,5 U g -1 e 20 U g -1 respectivamente, em 144 horas de fermentação.

4 84 Fermentação em estado sólido de diferentes resíduos para a obtenção de lípase microbiana Dantas &Aquino Quando utilizados como torta de babaçu e borra de café obteve-se máxima atividade hidrolítica de 25 U g -1 e 20 U g -1, respectivamente, em 168 horas de fermentação Teor de agua (% base seca) Borra de café Torta de babaçu Torta de mamona Semente de abóbora Casca de abacate Figura 1. Influência do teor de água do substrato na produção da enzima lipase Borra de café Torta de babaçu Torta de mamona Semente de abóbora Casca de abacate Tempo (horas) Figura 2. Cinética de produção enzimática através de FES utilizando diferentes resíduos agroindustriais Através dos resultados constatou-se que o tempo de fermentação variou significativamente com o tipo de substrato utilizado. Apesar da torta de babaçu conter 2,6% de lipídeos, obtevese maior atividade hidrolítica (24,6 U g -1 ) quando empregado este resíduo como substrato. Uma hipótese para este resultado seria que a presença de outros nutrientes pode ter contribuído para o crescimento do microrganismo. Além disso, como o teor de agua do substrato é um fator importante para o crescimento microbiano em fermentação em estado sólido, pode ter ocorrido maiores perdas de água durante a fermentação dos demais resíduos testados neste trabalho. Em comparação com pesquisadores que utilizaram resíduos para a produção de lipase verificou-se que Ul-Haq et al. (2002) obtiveram máxima atividade enzimática de 26,0 U g -1 utilizando farelo de trigo e o fungo Rhizopus oligosporous e Gombert et al. (1999) obtiveram máxima atividade enzimática de aproximadamente 6,0 U g -1 utilizando torta de babaçu e Penicillium restrictum. Os resíduos testados neste trabalho demonstraram potencial para a produção de lipase. Experimentos foram realizados para determinar o ph ótimo de atividade enzimática do EBE obtido através da FES dos diferentes resíduos. As reações foram realizadas em

5 Fermentação em estado sólido de diferentes resíduos para a obtenção de lípase microbiana Dantas &Aquino 85 diferentes tampões com phs variando entre 2,0 e 8,0. Os resultados obtidos estão apresentados na Figuras 3 e ph Torta de babaçu Torta de mamona Casca de abacate Figura 3. Influência do ph na atividade hidrolítica do EBE obtido a partir de torta de babaçu, torta de mamona e cascas de abacate. Os resultados demonstraram que a atividade hidrolítica do extrato bruto enzimático (EBE) produzido a partir dos resíduos agroindustriais diminuiu com o aumento do ph, sendo o valor máximo obtido em ph 2,0, o que demonstrou o caráter acídico da enzima. Os EBEs obtidos a partir de borra de café, torta de babaçu, torta de mamona, sementes de abóbora e cascas de abacate demonstraram máxima atividade hidrolítica (em ph 2,0) de 2000 U g -1, 3278 U g -1 ; 789 U g -1 e 2603 U g -1, respectivamente. De maneira geral os pesquisadores têm obtido lipases microbianas com máxima atividade enzimática em ph próximo a neutralidade (Kamini et al, 1998; Hiol et al., 2000; Abbas et al., 2002; Diaz et al., 2006) ph Borra de café Semente de abóbora Figura 4. Influência do ph na atividade hidrolítica do EBE obtido a partir de borra de café e sementes de abóbora. Apesar disto, alguns autores têm produzido lipase microbiana com caráter acídico, tais como Mahadik et al., 2002 os quais obtiveram lipase a partir de farelo trigo utilizando Aspergillus niger, com máxima atividade enzimática em ph 2,5, Mahadik et al., 2004 obtiveram lipase acídica por fermentação submersa em ph 5,5 utilizando Aspergillus niger e Mehtra et al., 2009 obtiveram lipase por fermentação submersa utilizando Aspergillus niger com máxima atividade enzimática em ph 2,5 e temperatura de 50 C. Definido o ph onde obteve-se máxima atividade lipásica, a etapa seguinte foi avaliar a influência da temperatura. A mistura reacional EBE, óleo de oliva e tampão acetato de sódio ph 2,0 foi mantida sob agitação em diferentes temperaturas variando entre 30 C e 70 C durante 60 min e a atividade hidrolítica foi determinada com descrito anteriormente. Os resultados estão demonstrados nas Figuras 5 e Temperatura ( C) Borra de café Torta de babaçu Casca de abacate Figura 5. Influência da temperatura na atividade hidrolítica do EBE obtido a partir de borra de café, torta de babaçu e cascas de abacate Torta de mamona Semente de abóbora Temperatura ( C) Figura 6. Influência da temperatura na atividade hidrolítica do EBE obtido a partir de torta de mamona e sementes de abóbora.

6 86 Fermentação em estado sólido de diferentes resíduos para a obtenção de lípase microbiana Dantas &Aquino O EBE obtida a partir da borra de café, torta de mamona, cascas de abacate, sementes de abóbora e torta de babaçu demonstrou máxima atividade enzimática (em ph 2,0) nas temperaturas de 40 C; 50 C; 40 C; 70 C e 30 C, respectivamente. Os resultados estão em acordo com outros pesquisadores, os quais obtiveram lipases microbianas com máxima atividade enzimática em temperaturas de 35 C (Hiol et al., 2000); 30 C (Ul-Haq et al., 2002); 37 C (Kamine et al., 1998); 45 C (Mahadik et al, 2002) e 50 ºC (Koblitz e Pastore, 2006). CONCLUSÕES Apesar de serem produzidas na maioria das pesquisas lipases com caráter básico, nas condições propostas neste trabalho, a enzima produzida a partir dos resíduos sementes de abóbora, cascas de abacate, torta de babaçu, torta de mamona e borra de café, apresentou maior atividade hidrolítica em ph 2,0, o que caracterizou a provável produção de lipase acídica. Maior produção enzimática (25 U g -1 ) foi obtida na fermentação em estado sólido de torta de babaçu contendo um teor de água de 45% durante 168 horas. Dentre os resíduos testados, a lipase obtida a partir de torta de babaçu foi a que apresentou maior atividade hidrolítica (3278 U g -1 ) em ph 2,0 e temperatura de 30 C. Os resíduos agroindustriais, sementes de abóbora, cascas de abacate, torta de babaçu, torta de mamona e borra de café, os quais tradicionalmente são descartados em lixos ou solo apresentaram potencial para a obtenção de lipase acídica. Com exceção da torta de mamona e da torta de babaçu (provenientes do processamento de biodiesel e de indústrias de refino de óleos), não há relatos na literatura consultada do emprego dos demais resíduos testados neste trabalho como substrato para a obtenção de lipase microbiana. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abbas, H.; Hiol, A.; Deyris, V.; Comeau, L. Isolation and characterization of an extracellular lipase from Mucor sp strain isolated from palm fruit. Enzyme and Microbial Technology, v. 31, p , Coelho, M. A. Z.; leite, S. G. F.; Rosa, M. D. F.; Furtado, A. A. L. Aproveitamento de resíduos agroindustriais: produção de enzimas a partir da casca de coco verde. Boletim do Ceppa, v. 19, n. 01, p. 3342, Couto, S. R.; Sanroman, M. A. Application of solid-state fermentation to food industry A review. Journal of Food Engineering, v. 76, p , Diaz, J. C. M.; Rodrıguez, J.A.; Roussos, S.; Cordova, J.; Abousalham, A.; Carriere, F.; Baratti, J. Lipase from the thermotolerant fungus Rhizopus homothallicus is more thermostable when produced using solid state fermentation than liquid fermentation procedures. Enzyme and Microbial Technology, v. 39, p , Godoy, M.G.; Gutarra, M.L.E; Maciel, F.M.; Shayany P.F.; Bevilaqua, J.V.; Machado, O.L.T.; Freire, D.M.G. Use of a low-cost methodology for biodetoxification of castor bean waste and lipase production. Enzyme and Microbial Technology, v. 44, p , Gombert, A. K.; Pinto, A.L.; Castilho, L.R.; Freire, D.M.G. Lipase production by Penicillium restrictum in solid-state fermentation using babassu oil cake as substrate. Process Biochemistry, v. 35, p , Graminha, E.B.N.; Gonçalves, A.Z.L.; Pirota, R.D.P.B.; Balsalobre, M.A.A; Gomes, E.R.S. Enzyme production by solid-state fermentation: Application to animal nutrition. Animal Feed Science and Technology, v. 144, p. 1 22, Hiol, A.; Jonzo, M.D.; Rugani, N.; Druet, D.; Sarda, L.; Comeau, L.C. Purification And Characterization Of An Extracellular lipase from a thermophilic Rhizopus oryzae strain isolated from palm fruit. Enzyme and Microbial Technology, v. 26, p , Ul-Haq, I.; Idrees, S.; Rajoka M. I. Production of lipases by Rhizopus oligosporous by solid-state fermentation. Process Biochemistry, v. 37, p , Kamini, N. R.; Mala, J. G. S.; Puvanakrishnan, R. Lipase production from Aspergillus niger, by solid-state fermentation using gingelly oil cake. Process Biochemistry, v. 33, n. 05, p , Koblitz, M. G. B.; Pastore, G. M. Purification and biochemical characterization of an extracellular lipase produced by a new strain of rhizopus sp. Ciência Agrotécnica, v. 30, n. 03, p , Mahadik, N. D.; Puntambekar, U. S.; Bastawde, K. B.; Khire, J. M.; Gokhale, D.

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