PRÉ-TRATAMENTO DE ÓLEO RESIDUAL DE FRITURA UTILIZANDO LIPASE DE Aspergillus niger EM EXTRATO BRUTO EM MEIO ULTRASSÔNICO
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- Sarah Bonilha Regueira
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1 PRÉ-TRATAMENTO DE ÓLEO RESIDUAL DE FRITURA UTILIZANDO LIPASE DE Aspergillus niger EM EXTRATO BRUTO EM MEIO ULTRASSÔNICO G. D. L. P. VARGAS 1, J. MULINARI 1, S. M. GOLUNSKI 1, C. TORBES 1 e H. TREICHEL 1 1 Universidade Federal da Fronteira Sul, campus Erechim para contato: geandelise@uffs.edu.br RESUMO Estimativas apontam que um litro de óleo descartado de forma inadequada contamina cerca de um milhão de litros de água. Desse modo, a busca por técnicas de pré-tratamento do óleo residual de fritura é de grande importância. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a hidrólise em ultrassom do óleo residual gerado na cantina da Universidade Federal da Fronteira Sul campus Erechim, utilizando lipase de Aspergillus niger em extrato bruto. A hidrólise foi avaliada através de planejamento experimental do tipo DCC (Delineamento Composto Central), variando-se a relação óleo:água (v/v) e a quantidade de enzima, sendo o tempo de reação determinado através de cinética. A temperatura e frequência ultrassônica também foram avaliadas por planejamento experimental do tipo DCC. Os resultados mostraram que o melhor tempo de reação foi de 12 horas, utilizando 15% (v/v) de lipase, relação óleo:água de 1:3, temperatura de 45 o C e frequência ultrassônica de 50%, obtendo-se a conversão de 62,7 AGL. 1. INTRODUÇÃO O óleo residual de fritura é gerado em praticamente todos os lugares, principalmente em áreas urbanas com grande consumo de óleos vegetais refinados em domicílios, restaurantes, padarias, indústrias de processamento de alimentos, etc. (Kumar et al., 2012; Araújo et al., 2013). Grande parte do óleo utilizado para fritura é descartado de forma inadequada, sendo lançado no sistema de esgotos, no solo ou diretamente em corpos d água, o que causa poluição das águas e sobrecarga das estações de tratamento (quando existem), contaminação de lençóis freáticos, infertilidade do solo, diminuição da concentração de oxigênio na água, mortandade de peixes, proliferação de organismos indesejáveis e aumento de gases formadores de odores (Pinto-Coelho, 2009). Além dessas formas de descarte inadequadas, uma parte do óleo pode ser encaminhada para aterros sanitários junto aos resíduos domésticos. No aterro, o óleo exige enzimas especiais para a sua decomposição completa, as lipases. Essas enzimas, muitas vezes, não são sintetizadas pelos microrganismos decompositores na quantidade necessária para degradar todo o óleo presente nos resíduos (Pinto-Coelho, 2009).
2 Dessa maneira, os impactos negativos dos óleos residuais podem ser minimizados pela utilização de enzimas microbianas hidrolíticas como a lipase. A pré-hidrólise dos resíduos de óleos pela lipase melhora a eficiência de remoção e acelera o processo de degradação (Kumar et al., 2012). Os produtos da hidrólise são rapidamente absorvidos pela membrana plasmática semipermeável dos microrganismos, podendo criar um ambiente livre de lipídios (Kumar et al., 2012). Com base nisso e visando aumentar a eficiência da pré-hidrólise do óleo residual, o meio reacional pode ser exposto a ondas ultrassônicas, que podem incrementar a atividade hidrolítica da lipase, já que aumentam as taxas de transferência de calor e massa na reação. O ultrassom é uma alternativa simples na otimização de processos enzimáticos, sendo uma tecnologia de alto rendimento e de baixo custo (Treichel et al., 2011). Portanto, buscando uma forma de pré-tratamento barato e eficiente do óleo residual de fritura da cantina da Universidade Federal da Fronteira Sul campus Erechim, foram realizados estudos utilizando lipase de Aspergillus niger na catálise de reações de hidrólise do óleo em meio ultrassônico. A enzima a ser utilizada foi produzida através de fermentação em estado sólido utilizando como substrato torta de canola conforme descrito em pesquisas anteriores (Sbardelotto et al., 2014). 2. MATERIAL E MÉTODOS A lipase utilizada neste estudo foi produzida por fermentação em estado sólido utilizando o fungo Aspergillus niger isolado por Rigo (2009) e torta de canola como substrato, em condições controladas de temperatura (27 o C), umidade (60% m/m) e nitrogênio (2% m/m) em 48 horas de fermentação (Sbardelotto et al., 2014). O óleo residual de fritura foi obtido junto à cantina da Universidade Federal da Fronteira Sul Campus Erechim- RS. A hidrólise do óleo residual de fritura catalisada pela lipase foi avaliada em termos de liberação de ácidos graxos livres. Os testes foram feitos em meio ultrassônico a 45 o C e 50% de potência ultrassônica (Golunski et al., 2015) com o auxílio de um agitador mecânico para promover a mistura da solução. O óleo foi adicionado à água destilada em diferentes proporções já que o ultrassom promove uma maior homogeneidade do meio. Desse modo, foram avaliadas a concentração de lipase e a relação óleo:água conforme o planejamento experimental do tipo DCCR descrito na Tabela 1. Preliminarmente à realização do planejamento foi efetuada uma cinética em condições fixas (relação óleo:água de 1:5 e 10% (v/v) de lipase) para determinar o tempo de reação a fim de promover a maior liberação de ácidos graxos livres, sendo os tempos testados de 4, 8 e 12 horas.
3 Tabela 1: Níveis do planejamento experimental Nível -1, ,41 Óleo : Água 1 : 2,17 1 : 3 1 : 5 1 : 7 1 : 7,83 Concentração de lipase (% v/v) 2, ,07 Para determinar a quantidade de ácidos graxos livres produzidos em cada reação foram retirados 10 ml do meio reacional, aos quais foram adicionados 10 ml de solução acetona:etanol (1:1) para cessar a reação. Desse modo, os ácidos graxos livres foram titulados com NaOH 0,02M até ph 11 (Freire et al., 1997). A fim de determinar apenas a quantidade de ácidos graxos livres liberados durante a reação, excluindo os que já compunham o óleo, um branco reacional foi realizado para cada ensaio, adicionando-se 10 ml de acetona:etanol a 10 ml do meio reacional antes de submetê-lo a reação enzimática. A partir disso, a quantidade de ácidos graxos livres (AGL) produzidos foi calculada através da Equação 1, onde V a é o volume de NaOH gasto nas amostras (ml), V b é o volume de NaOH gasto no branco reacional (ml), M é a molaridade do NaOH utilizado, V c é o volume de amostra utilizada na reação (ml), sendo expressa sua concentração em µmol/ml. ( V AGL = a V b )* M *1000 Vc (1) 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados da cinética realizada para a hidrólise do óleo residual de fritura mostraram que o tempo analisado que promoveu uma maior hidrólise do óleo foi o de 12 horas, sendo então utilizado para os demais testes. Os resultados são expressos em termos da quantidade de ácidos graxos livres gerados (AGL). Utilizando o tempo de 12 horas, realizou-se o planejamento experimental a fim de analisar a hidrólise do óleo residual com lipase em meio ultrassônico. Os ensaios realizados e as respectivas quantidades de ácidos graxos geradas são expressos na Tabela 2.
4 Tabela 2: Planejamento experimental e respectivos resultados de AGL Ensaio Óleo : água Concentração de lipase (%) AGL (µmol/ml) , , , ,84 5-1, , , , ,41 24, ,41 54, , , ,97 Analisando-se os resultados expressos na Tabela 2, verifica-se que a maior quantidade de ácidos graxos livres (62,67 µmol/ml) foi gerada no ensaio 3 com as condições de 1:3 (óleo:água) e 15% de enzima. Nota-se que as maiores quantidades de AGL foram obtidas para ensaios que continham menor quantidade de água e maiores concentrações de lipase. Os resultados do planejamento foram estatisticamente analisados e os resultados obtidos possibilitaram a obtenção de um modelo matemático otimizado (Equação 2) para a hidrólise do óleo residual de fritura catalisada por lipase em função da quantidade de ácidos graxos livres liberados (AGL), onde OA é a relação óleo:água e [E] é a concentração de enzima. Para validação do modelo foi realizada a análise de variância (ANOVA) apresentada na Tabela 3. Verifica-se que o coeficiente de correlação obtido (0,96) e o valor de F (F calculado maior que o F tabelado) validou o modelo (p<0,05), e permitiu a construção da superfície de resposta apresentada na Figura 2.
5 2 2 AGL = 44,13 10,74 * OA 5,94 * OA + 22,37 *[ E] 5,13*[ E] 10,54 * OA*[ E] (2) Tabela 3: Análise de variância para a hidrólise do óleo residual de fritura utilizando lipase Fonte de variação Soma dos quadrados Graus de liberdade Média quadrática F calculado Regressão 1406,28 5 Residual 48,21 5 Total 1454,49 10 R 2 = 0,96; F 0,05, 5,5 = 5, ,25 9,64 29,17 Figura 1 Superfície de resposta para a hidrólise do óleo residual de fritura utilizando lipase como catalisador. Analisando-se a superfície de resposta da Figura 1, verifica-se que as maiores quantidades de AGL foram obtidas nas maiores concentrações de lipase e nos ensaios que continham menor teor de água em relação ao teor de óleo. Os melhores resultados foram obtidos para a relação óleo:água de 1:3, o que condiz com os resultados do estudo de Merçon et al. (1996), que obtiveram uma proporção óleo:água ótima de 1:3 a 1:1,6 para a hidrólise de óleo de babaçu utilizando lipase de Mucor miehei e Candida cylindracea. Também coincide com a relação óleo:água de 1:3 encontrada para a hidrólise de óleo de soja catalisada por uma combinação de lipases de Thermomyces lanuginosus e Rhizomucor miehei (Rodrigues e Ayub, 2011).
6 No entanto, na maioria dos estudos envolvendo hidrólise enzimática de óleos, foram obtidos valores maiores para o teor de água, como o de Cavalheiro (2013) que obteve uma relação óleo:água de 1:21 para a hidrólise de óleo de canola utilizando lipases combinadas de Thermomyces lanuginosus e Rhizomucor miehei. Esses valores maiores para a quantidade de água devem-se ao fato de as reações não serem realizadas em meio ultrassônico. Segundo Gonçalves et al. (2012), o uso de ultrassom faz com que a área da interface óleo-água aumente, o que resulta em altas taxas de conversão de triglicerídeos a ácidos graxos livres mesmo em ambientes com menos água. Isso ocorre pois a lipase atua através da interface óleo-água e deve penetrar nela a fim de catalisar a reação desejada, assim, a área interfacial total livre é um fator importante para aumentar o desempenho da reação. Além disso, o uso de ultrassom não requer a adição de agentes emulsificantes, o que torna a tecnologia mais atrativa economicamente para a indústria, já que menos etapas operacionais são necessárias. Há vários registros na literatura (You e Baharin, 2006; Reis et al., 2009; Faria, 2010) indicando que com um leve aumento na quantidade de água na reação, ocorre um aumento de atividade devido à melhor conformação enzimática e à maior área de interface, porém a partir de uma quantidade máxima, pode ocorrer a inibição da atividade da enzima pelo alto teor de água. No estudo de Chu, Quek e Baharin (2003), verifica-se que altas concentrações de enzima e conteúdo de água na mistura reacional aumentaram a quantidade de ácidos graxos livres originados. No entanto, quando o conteúdo de água era maior que 55% (v/m), a quantidade de ácidos graxos livres começou a diminuir mesmo em altas concentrações de enzima. Segundo os autores, altos teores de água reduzem dramaticamente a atividade hidrolítica, o que pode ser atribuído ao efeito de diluição da concentração de lipase na fase aquosa. Haas et al. (1994) argumenta que os requisitos de água são diferentes para cada lipase e variam proporcionalmente à concentração do substrato. 4. CONCLUSÃO A partir dos resultados foi possível verificar que a condição que gerou a maior quantidade de ácidos graxos livres (62,67 µmol/ml) após as 12 horas de reação, foi utilizando uma relação óleo:água de 1:3 e 15% (v/v) de solução enzimática. O uso do ultrassom permitiu que a hidrólise ocorre-se mesmo com quantidades menores de água do que as utilizadas em outros estudos da área. Além disso, o meio ultrassônico permite que a reação de hidrólise ocorra mesmo sem a adição de agentes emulsificantes, o que pode servir de atrativo para a indústria já que o número de procedimentos operacionais é menor. Desse modo, a hidrólise do óleo residual de fritura catalisada pela lipase de Aspergillus niger em meio ultrassônico pode ser considerada um pré-tratamento do óleo por converter uma significativa quantidade de triglicerídeos em ácidos graxos livres, que são mais rapidamente metabolizados pelos microrganismos decompositores.
7 5. REFERÊNCIAS ARAÚJO, C. D. M.; ANDRADE, C. C.; SOUZA E SILVA, E.; DUPAS, F. A. Biodiesel production from used cooking oil: a review. Renewable and Sustainable Energy Reviews, n. 27, p , CAVALHEIRO, J. C. Hidrólise de óleo de canola catalisada por mistura de lipases imobilizadas Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação) Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, CHU, B. S.; QUEK, S. Y.; BAHARIN, B. S. Optimization of enzymatic hydrolysis for concentration of vitamin E in palm fatty acid distillate. Food Chemistry, v. 80, p , FARIA, L. A. Hidrólise do oleo de amêndoa da macaúba com lipase extracelular de Colletotrichum gloesporioides produzida por fermentação em substrato líquido Dissertação (Mestrado) Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, FREIRE, D. M.; TELES, E. M.; BOM, E. P.; SANT ANNA JR., G. L. Lipase production by Peniillium restrictum in a bench-scale fermenter: effect of carbon and nitrogen nutrition, agitation, and aeration. Applied Biochemistry and Biotechnology, California, v. 63, n. 4, p , GOLUNSKI, S. M.; SBARDELOTTO, M.; CAMARGO, A. F.; DALLA ROSA, C.; VENTURIN, B.; DALL AGNOL, A.; BALDISSARELI, D. P.; TORBES, C.; VARGAS, G. D. L. P.; MOSSI, A.; TREICHEL, H. Efeito do ultrassom na atividade da enzima lipase obtida a partir do fungo Aspergillus niger. In: Simpósio Nacional de Bioprocessos, 20., 2015, Fortaleza, Anais... Fortaleza: UFCE, GONÇALVES, K. M.; SUTILI, F. K.; LEITE, S. G. F.; SOUZA, R. O. M. A.; LEAL, I. C. R. Palm oil hydrolysis catalyzed by lipases under ultrasound irradiation: the use of experimental design as a tool for variables evaluation. Ultrasonic Sonochemistry, v. 19, p , HAAS, M.J.; SCOTT, K.; JUN, W.; JANSSEN, G. Enzymatic phosphatidylcholine hydrolysis in organic solvents: an examination of selected commercially available lipases. J. Am. Oil Chem. Soc., v. 71, p , KUMAR, S.; MATHUR, A.; SINGH, V.; NANDY, S.; KHARE, S. K.; NEGI, S. Bioremediation of waste cooking oil using a novel lipase produced by Penicillium chrysogenum SNP5 in solid medium containing waste grease. Biosource Technology, n. 120, p , MERÇON, F.; ERBES, V. L.; SANT ANNA JR., G. L.; NOBREGA, R. Efeitos hidrodinâmicos no processo de hidrólise enzimática de óleos em reatores com membranas. In: Seminário de Hidrólise Enzimática de Biomassa, 4., 1996, Maringá, Anais... Maringá: UEM, REIS, P.; HOLMBERG, K.; WATZKE, H.; LESER, M. E.; MILLER, R. Lipases at interfaces: a review. Adv. Colloid Interface Sci., v , p , SBARDELOTTO, M.; DALL AGNOL, A.; VENTURIN, B.; MULINARI, J.; SILVA, M. F.; VARGAS, G. D. L. P.; TREICHEL, H. Estudo da producao, extracao e caracterizacao de lipase microbiana utilizando torta de canola como substrato. In: Seminário Brasileiro de Tecnologia Enzimática, 11., 2014, Rio de Janeiro, Anais... Rio de Janeiro: UFRJ, 2014.
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