ESTUDO DA EFICIÊNCIA DA AÇÃO DE α-amilase BACTERIANA COMERCIAL PARA HIDRÓLISE DE AMIDO EM MALTODEXTRINA

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1 ESTUDO DA EFICIÊNCIA DA AÇÃO DE α-amilase BACTERIANA COMERCIAL PARA HIDRÓLISE DE AMIDO EM MALTODEXTRINA Marcelio Vilhena Silva 1, Elizama Aguiar-Oliveira 2, Eliana Setsuko Kamimura 3*, Rafael Resende Maldonado 1,4 1 Faculdade Municipal Professor Franco Montoro, R. dos Estudantes s.n., Mogi Guaçu, São Paulo, Brasil. 2 Universidade Federal da Bahia, campus Anísio Teixeira, Instituto Multidisciplinar em Saúde (IMS-CAT/UFBA), Departamento de Biociências, R. Rio de Contas, 58, Candeias, Vitória da Conquista, Bahia, Brasil. 3 Universidade de São Paulo, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos (FZEA), Laboratório de Bioprocessos, Av. Duque de Caxias Norte, 235, Campus USP, Pirassununga, São Paulo, Brasil. 4 Universidade Estadual de Campinas, Colégio Técnico de Campinas (COTUCA),Departamento de Alimentos, R. Jorge Figueiredo Corrêa, 735, Parque Taquaral, Campinas, São Paulo, Brasil. para contato: ratafta@yahoo.com.br RESUMO Maltodextrina pode ser produzida pela ação hidrolítica das α-amilases sobre o amido e a otimização deste processo visa redução de custos sem perda de eficiência. Este estudo teve por objetivo avaliar a hidrólise do amido à maltodextrina por uma α-amilase comercial através de delineamentos fatoriais com as varáveis independentes: razão enzima/amido, concentração de amido, ph e temperatura. Os resultados obtidos permitiram a obtenção de uma conversão de 12,4% de dextrose equivalente após 30 min de reação com economia de 5% sobre o consumo de enzima. As melhores condições de hidrólise foram determinadas como: 190 µl de enzima por kg de amido, 20 Be de amido, ph = 6,0, 200 ppm de cálcio, 96 C e 400 rpm de agitação. 1. INTRODUÇÃO Depois da celulose, o amido é o segundo maior polissacarídeo de reserva dos vegetais e é o substrato fundamental para as amilases, pois é composto basicamente por glicoses ligadas entre si de forma linear (α-1,4) ou ramificada (α-1,6) (Agrawal et al., 2005; Sharma & Satyanarayana, 2013). Amido hidrolisado tem diversas aplicações nas indústrias de alimentos, bebidas, farmacêutica, têxtil, detergentes, etc e por estes motivos as amilases (E.C ) são as enzimas mais importantes tanto para hidrólise como sacarificação de carboidratos (Amid & Manap, 2014).

2 Tendo como base a faixa de hidrólise (conversão) do amido à maltodextrina de 10 a 14% dextrose equivalente (DE), normalmente relacionada à maltodextrina comercial proveniente do amido de milho (Coutinho, 2007), o objetivo desse estudo foi avaliar as melhores condições de hidrólise do amido à maltodextrina pela α-amilase comercial de Bacillus Licheniformis (Termamyl 120 L, Novozymes), em escala laboratorial, por meio de delineamentos fatoriais. 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1. Materiais A amilase empregada neste trabalho foi α-amilase bacteriana (Termamyl 120 L, Novozymes) com atividade de 120 KNUT (1 KNUT equivale a quantidade de enzima que dextriniza 5,26 g de amido seco por hora a 37 C e ph 7,1) Hidrólise enzimática do amido Ensaios preliminares foram realizados para verificar o tempo necessário para conversão enzimática (hidrólise) do amido à maltrodextrina na faixa de 10 a 14% de DE. Para tanto, adicionou-se 500 g de solução de amido (19 Be 33,63%m/m de substância seca) e cálcio (200 ppm) ao recipiente de reação. A temperatura das amostras foi ajustada para 45 C e adicionou-se 0,1 ml da solução enzimática comercial; o ph foi ajustado, para 6,0, com adição de CaCO 3 sólido e a temperatura do sistema foi então elevada para 96 C e a agitação fixada em 400 rpm. Os tempos de reação avaliados foram de 10, 20, 30, 40, 50 e 60 minutos de hidrólise. Ao término de cada intervalo, a reação foi paralisada com adição de HCl 2,5 mol/l até os sistemas atingirem ph 4,0. De cada condição avaliada determinou-se a quantidade de maltodextrina produzida, expressa em % DE. Após realização dos ensaios preliminares, selecionou-se o tempo de 30 minutos como suficiente para atingir a concentração de maltodextrina entre 10 e 14% DE. Com esta condição foi realizado um delineamento experimental fracionário (Rodrigues & Iemma, 2014) para avaliar os efeitos das variáveis independentes: razão enzima/amido (180 a 200 μl enzima / kg de solução de amido), concentração de amido (19 a 20 Be), ph (6,0 a 6,5) e temperatura de hidrólise (93 a 96 C). As condições de cada experimento do delineamento fatorial fracionário encontram-se na Tabela 1. Na sequência realizou-se um segundo delineamento experimental, do tipo central composto rotacional (DCCR) pontos axiais + 3 pontos centrais. Para esta etapa, foram avaliadas as variáveis independentes: razão enzima/amido e ph nas faixas de 176 a 204 µl/kg e 5,7 a 6,3, respectivamente, sendo fixados temperatura e concentração de amido em 96 C e 20 Be, respectivamente. A Tabela 3 apresenta a matriz deste delineamento. Todas as hidrólises enzimáticas foram realizadas em um copo de Keller de 500 ml, acoplado em banho-maria(tipo Blattman ). As análises estatísticas foram feitas no programa Statistica Determinação da concentração de maltodextrina

3 A concentração de maltodextrina foi determinada pelo método de Fehling. Após o final da hidrólise, a solução obtida foi filtrada e 100 g do filtrado foram transferidos para balão volumétrico de 500 ml, que teve volume completado com água destilada e homogeneizado por agitador magnético. A solução diluída foi utilizada para titular 25 ml da solução padrão de Fehling contida em erlenmeyer de 250 ml e mantida sob aquecimento, até o completo desaparecimento da coloração azul e do precipitado avermelhado, com auxílio do indicador azul de metileno. A partir do volume gasto na titulação determinou-se a quantidade de dextrose equivalente (% DE) em cada amostra, conforme a relação: %DE=100%*[F/(SS.m.V)], sendo F o fator da solução de Fehling, SS a concentração de sólidos solúveis na amostra hidrolisada, m a massa da amostra hidrolisada (g) e V o volume da amostra hidrolisada e diluída utilizados na titulação (ml). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados obtidos com os ensaios preliminares indicaram uma conversão enzimática linearmente proporcional ao tempo de hidrólise (R 2 = 0,96 e inclinação de 0,18 %DE min -1 ), sob as condições avaliadas; isso sugere que tempo apresentou um efeito positivo sobre a conversão de amido em maltodextrina. Tendo sido pré-definida a concentração de maltodextrina desejada (10-14% DE), o tempo de hidrólise adequado encontra-se entre 20 e 40 minutos, assim sendo, o tempo de 30 min foi selecionado para a próxima etapa por ser o valor médio. Os efeitos das variáveis independentes razão enzima/amido, concentração de amido, ph e temperatura sobre a conversão enzimática de amido à maltodextrina utilizando α-amilase bacteriana comercial foram avaliados através de delineamento fatorial fracionário A matriz do delineamento, os resultados obtidos e o efeito de cada variável estão nas Tabelas 1 e 2. Tabela 1. Delineamento fatorial fracionário para conversão de amido à maltodextrina por α- amilase comercial com as variáveis independentes: razão enzima/amido, concentração de amido, ph e temperatura e a variável resposta concentração de maltodextrina, após 30 min a 400 rpm. Experimentos Enzima/Amido Amido Temperatura Maltodextrina ph (μlenz/kgamido) ( Be) ( C) (%DE) (-1) 19 (-1) 6,0 (-1) 90 (-1) 10, (+1) 19 (-1) 6,0 (-1) 96 (+1) 13, (-1) 20 (+1) 6,0 (-1) 96 (+1) 11, (+1) 20 (+1) 6,0 (-1) 90 (-1) 11, (-1) 19 (-1) 6,5 (+1) 96 (+1) 10, (+1) 19 (-1) 6,5 (+1) 90 (-1) 10, (-1) 20 (+1) 6,5 (+1) 90 (-1) 9, (+1) 20 (+1) 6,5 (+1) 96 (+1) 12, (0) 19.5 (0) 6,25 (0) 93 (0) 12, (0) 19.5 (0) 6,25 (0) 93 (0) 12, (0) 19.5 (0) 6,25 (0) 93 (0) 12,4

4 Tabela 2. Efeitos das variáveis no delineamento fatorial fracionário para a conversão enzimática de amido à maltodextrina após 30 minutos de reação a 400 rpm. Efeito Erro Variável t(7) Valor-p (%DE) Padrão Média 11,00 0,09 119,9 <0,001* Curvatura 2,53 0,35 7,21 < 0,001* Razão enzima/amido 1,10 0,18 5,99 0,002* Concentração de amido 0,25 0,18 1,36 0,231 ph -0,90 0,18-4,90 0,004* Temperatura 1,75 0,18 9,54 <0,001* Em relação à razão enzima/amido, o aumento na quantidade de enzima levou a um aumento na taxa de conversão; entretanto, do ponto de vista industrial não há interesse de se aumentar demasiadamente a conversão enzimática visto que a faixa de conversão desejável é de 10 e 14% DE, além disso, a diminuição da quantidade de enzima é interessante em termos de custos, sendo assim, para o próximo delineamento decidiu-se ampliar a faixa de concentração da enzima. A concentração de amido não apresentou efeito significativo na faixa estudada, por isso, decidiu-se utilizar a concentração mais elevada, uma vez que em geral, esta seria a condição mais próxima de uma situação industrial. Já o ph apresentou um efeito negativo e estatisticamente significativo, indicando que em ph 6,0 a ação da enzima foi mais eficiente; além disso, dados do fabricante indicam que a enzima utilizada apresenta ph ótimo na faixa entre 5,8 e 6,2, dessa forma, a faixa de valores de ph foi pouco alterada para o próximo delineamento. Para a temperatura, o efeito foi positivo e estatisticamente significativo, no entanto, o nível +1 encontra-se no valor máximo fornecido pelo equipamento utilizado nesse estudo, sendo assim, para o próximo delineamento, a temperatura foi fixada no nível mais alto, ou seja, 96 C. Por fim, a análise da curvatura foi estatisticamente significativa para o delineamento fracionário, o que sugere, a partir dos resultados dos pontos centrais, que um modelo de 2ª ordem deve ser adequado para explicar o processo avaliado dentro das faixas avaliadas (Rodrigues& Iemma, 2014). Com base na análise do delineamento fracionário realizou-se um delineamento completo pontos axiais + 3 pontos centrais para avaliar os novos níveis das variáveis independentes: razão enzima/amido e ph sobre a conversão de amido à maltodextrina. As condições utilizadas em cada ensaio e os resultados obtidos estão Tabela 3 e a análise de variância (ANOVA) se encontra na Tabela 4. Os melhores resultados obtidos para a conversão enzimática de amido à maltodextrina ocorreram nos ensaios dos pontos centrais (Tab. 3), com média de (12,37 ± 0,06)%DE e no ensaio 6, com 12,8%DE. Para a ANOVA foram considerados apenas os efeitos estatisticamente significativos (p< 0,10): termos linear e quadrático para razão enzima/amido e o termo quadrático para ph. Dessa forma, o modelo codificado e reduzido que explica a conversão de amido em maltodextrina dentro das condições estudadas é representado por (DE)=12,36+0,73(R)-0,66(R 2 )-0,73(P 2 ), em que DE é a conversão de amido em maltodextrina, R é a razão enzima/amido e P o ph do meio reativo. O modelo descrito apresentou teste F de 5,37 e é estatisticamente significativo e predito com 97% de confiança (p = 0,03). No entanto, o valor de R 2 foi relativamente baixo (0,70), indicando que o modelo consegue explicar apenas 70% da variabilidade dos dados experimentais. Entretanto, o

5 modelo pode ser considerado adequado para explicar o estudo realizado, uma vez que as faixas utilizadas para cada variável foram bastante reduzidas, o que indica que uma pequena variação pode afastar consideravelmente a resposta obtida do valor predito pelo modelo. Os valores preditos pelo modelo e os desvios relativos com relação aos valores experimentais podem ser visualizados na Tabela 3, na qual se verifica que o maior erro relativo foi de 10% e que, nas condições do ponto central (melhores resultados), os erros relativos obtidos foram baixos. Tabela 3. Delineamento fatorial completo pontos axiais + 3 pontos centrais para conversão enzimática de amido à maltodextrina utilizando α-amilase comercial, sendo as variáveis independentes a razão enzima/amido e o ph e a variável resposta a concentração de maltodextrina As hidrólises foram conduzidas a 96 C e 400 rpm por 30 minutos, concentração de amido e de cálcio de 20 Be e 200 ppm, respectivamente. Os dados foram analisados com o software Statistica 8.0 (StatSoft) e os valores preditos pelo modelo de segunda ordem também são apresentados. Experimentos Enzima/Amido (μlenz/kgamido) ph Maltodextrina Observada (%DE) Maltodextrina Predita (%DE) Desvio padrão (%) (-1) 5,8 (-1) 11,0 10,2 7, (+1) 5,8 (-1) 11,7 11,7 0, (-1) 6,2 (+1) 11,0 10,2 7, (+1) 6,2 (+1) 10,8 11,7-7, (-1,41) 6,0 (0) 9,0 10,0-10, (+1,41) 6,0 (0) 12,8 12,1 5, (0) 5,7 (-1,41) 11,0 10,9 0, (0) 6,3 (+1,41) 10,5 10,9-3, (0) 6,0 (0) 12,4 12,4 0, (0) 6,0 (0) 12,3 12,4-0, (0) 6,0 (0) 12,4 12,4 0,0 Tabela 4. Análise de variância (ANOVA) para a conversão enzimática de amido à maltodextrina utilizando α-amilase comercial. Os dados foram obtidos com o software Statistica 8.0 (StatSoft). Variável Soma dos Quadrados Grau de Liberdade Soma dos Quadrados Médios Teste F Valor-p Média 8, ,85 5,37 0,03 Curvatura 3, ,53 Razão enzima/amido 3, ,74 Concentração de amido 0, ,0035 ph 12, Sendo o modelo estatisticamente significativo e preditivo, foi possível realizar a análise de superfície de resposta (dados não apresentados), da qual foi possível observar que a melhor região para conversão do amido em maltodextrina, nas condições avaliadas, é com a razão enzima/amido entre 190 e 200 µl/kg (níveis 0 e +1) e ph entre 5,9 e 6,1 (níveis -0,5 e 0,5). A região de ph obtida

6 encontra-se dentro da faixa ótima indicada pelo fabricante (5,8 a 6,2) e a razão enzima/amido de 190 µl/kg representa redução de 5% em relação a quantidade recomendada pelo fabricante. Comparativamente, a hidrólise enzimática avaliada nesse trabalho foi mais eficiente do que a realizada por Božić et al. (2011) que obtiveram 37% de hidrólise após 4 h (ph 6,5 e 65 C) sobre amido de milho com α-amilase de B. lincheniformes ATCC 9945a, apesar do resultado 3 vezes maior, o tempo de hidrólise obtido por esses pesquisadores foi 8 vezes maior, levando a uma menor produtividade. Em outro estudo (Apar e Özbek, 2004), sob as condições de ph 6,0, 60 C, 300 rpm e 30 min a α-amilase comercial de Bacillus sp. (Sigma ) apresentou um grau de hidrólise de 47% em reator, uma conversão quase duas vezes maior que o resultado desse trabalho; esses autores utilizaram 1,4 g de enzima/l, mas a atividade enzimática não foi mencionada. 4. CONCLUSÃO Neste estudo foi possível obter uma condição ótima para a conversão de amido para maltodextrina utilizando a enzima comercial α-amilase considerando a faixa de conversão desejável para a aplicação industrial de 10 a 14% DE. As melhores condições obtidas foram: temperatura (96 C), concentração de amido (20 Be), razão enzima/amido (entre 190 a 200 µl/kg) e ph (entre 5,9 e 6,1) que resultaram em conversão média de 12,36% (DE), com condições de reação de 200 ppm de cálcio, agitação de 400 rpm e tempo de reação de 30 minutos. 5. REFERÊNCIAS Agrawal, M., Pradeep, S., Chandraraj, K., Gummadi, S.N Hydrolysis of starch by amylase from Bacillus sp. KCA102: a statistical approach. Process Biochemistry, 40, Amid, M., Manap, M.Y.A Purification and characterisation of a novel amylase enzyme from red pitaya (Hylocereuspolyrhizus) peel. Food Chemistry, Apar, D.K., Özbek, B α-Amylase inactivation during corn starch hydrolysis process. Process Biochemistry, Božić, N., Ruiz, J., López-Santín, J.,Vujčić, Z Production and properties of the highly efficient raw starch digesting α-amylase from a Bacillus licheniformis ATCC 9945a. Biochemical Engineering Journal, 53(2), Coutinho, A.P.C Produção e caracterização de maltodextrinas a partir de amidos de mandioca e batata doce. Tese de Doutorado, Faculdade de Agronomia, Universidade Estadual Paulista (UNESP) campusbotucatú, Botucatú, São Paulo. Rodrigues, M.I., Iemma, A.F Experimental Design and Process Optimization; CRC Press, Boca Raton, USA. Sharma, A., Satyanarayana, T Microbial acid-stable α-amylases: Characteristics, genetic engineering and applications. Process Biochemistry, 48,