PREPARAÇÃO DE CÉLULAS COMPETENTES DE Escherichia coli HB101

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1 PREPARAÇÃO DE CÉLULAS COMPETENTES DE Escherichia coli HB101 OBJECTIVO Obtenção de células competentes de Escherichia coli através de um método químico, para transformação de DNA plasmídico INTRODUÇÃO O processo de transformação consiste na introdução de DNA exógeno em células bacterianas. As células que possuem a competência natural de incorporar DNA do meio circundante verifica-se apenas para determinadas espécies e em condições fisiológicas específicas (por exemplo, membros do género Bacillus and Streptococcus). Assim, é necessário tornar as células competentes para ser possível a introdução de DNA recombinante, nas células que não têm esta competência natural. A preparação de células competentes pode ser efectuada através de métodos físicos e/ou químicos, que vão alterar a permeabilidade da parede celular, reforçando a sua capacidade de incorporar DNA exógeno. O processo químico mais usado é o método com cloreto de cálcio, que apresenta diversas vantagens, nomeadamente o facto de ser um processo simples e não necessitar de equipamento específico. A estirpe bacteriana utilizada neste procedimento experimental é a Escherichia coli HB101 K-12, que é uma estirpe híbrida de E. coli K12 e E. coli B. É uma estirpe clássica em aplicações de biologia molecular e engenharia genética, sendo reca- (mutação no gene responsável da recombinação e reparação de DNA e por conseguinte esta mutação elimina a recombinação geral) aumenta a estabilidade do DNA a incorporar. Estas células são sensíveis a antibióticos comuns, como ampicilina, canamicina, cloranfenicol e tetraciclina, mas apresentam resistência à estreptomicina. Preparação de Células Competentes de Escherichia coli HB101 Página 10

2 MATERIAIS E MÉTODOS MATERIAIS - Placas de Petri; - Balões Erlenmeyer; - Seringas; - Filtros de seringa (0.45 µm); - Frascos Schott; - Pipetas graduadas; - Provetas; - Micropipetas; - Tubos de centrífuga; - Autoclave; - Estufa; - Incubadora; - Incubadora com agitação orbital; - Espectrofotómetro UV-Vis; - Eléctrodo de ph; - Centrifuga refrigerada. MÉTODOS Preparação de soluções e meios de cultura ml de Meio Lúria Bertani (LB) liquído: Triptona 10g/L; NaCl 10g/L; Extracto de levedura 5g/L Ajuste o ph a 7.2 e esterilize no autoclave (15 min a 121ºC) ml de Meio LB sólido : Triptona 10g/L; NaCl 10g/L; Preparação de Células Competentes de Escherichia coli HB101 Página 11

3 Extracto de levedura 5g/L Agar purificado 2% (m/v); aferir ph = 7.2 e esterilizar no autoclave (15 min a 121ºC); transferir para placas de Petri, devidamente identificadas. 3. Solução de glicerol a 50% (v/v) 10mL; esterilize no autoclave (15 min a 121ºC) ml de uma solução de CaCl 2 0.1M; esterilize por filtração através de um filtro estéril de 0.45 µm. 5. Preparar à chama, 20 ml de uma solução de CaCl 2 0.1M contendo glicerol a 15% (v/v). Preparação das células competentes 1. Inocule a suspensão celular de E. coli HB101 em 2 placas de LB sólido, utilizando a técnica do riscado. 2. Incube as placas a 37 ºC, overnight. 3. Seleccione uma colónia isolada e inocule um balão Erlenmeyer contendo LB liquído (10 ml). Incube a 37ºC e a 180 rpm, overnight. 4. Retire 2 ml de meio LB e guarde num tubo de ensaio, para posteriormente ler a absorvância a 540 nm do ensaio em branco. 5. Inocule 100 ml de LB com 10% (v/v) do pré-inóculo crescido durante a noite. Incube a 37ºC e a 200 rpm. 6. Monitorize o crescimento microbiano, retirando tomas de 1mL do caldo de fermentação e registe a A 540, contra a amostra em branco, de 20 em 20 minutos, até atingir um valor de Transfira rapidamente a cultura para tubos de centrífuga e coloque de imediato num banho de gelo durante 20 minutos. 8. Centrifugue a 1000 g durante 5 minutos a 4ºC. 9. Remova o sobrenadante, por decantação e ressuspenda as células obtidas em 4 ml da CaCl M gelado. 10. Transfira a suspensão celular para tubos de centrífuga e incube durante 30 minutos num banho de gelo. 11. Centrifugue a g durante 5 minutos a 4ºC. Todas as ressuspensões celulares devem ser efectuadas no mesmo tubo/frasco e as células devem ser conservadas no gelo até ao fim da experiência. Transporte os tubos no banho de gelo no laboratório. Preparação de Células Competentes de Escherichia coli HB101 Página 12

4 12. Remova o sobrenadante e ressuspenda em 6 ml de CaCl 2 contendo glicerol a 15% (v/v) gelado. 13. Transfira alíquotas de 200 µl desta suspensão celular para tubos eppendorf estéreis e previamente incubados em banho de gelo. 14. Coloque os tubos eppendorf em azoto líquido durante 15 a 20 minutos e rapidamente transfira a 80ºC (podem ser conservadas até 6 meses). Nota: Durante este procedimento, as células devem ser manipuladas com muito cuidado. Não devem ser agitadas no vortex ou por pipetagem excessiva, principalmente quando são ressuspendidas em CaCl 2, uma vez que pode ocorrer lise celular, reduzindo assim a quantidade de células competentes. Também, dependendo da concentração celular, baixos ou elevados volumes de CaCl 2 podem ser usados para aumentar a concentração de células por tubo. Preparação de Células Competentes de Escherichia coli HB101 Página 13

5 QUESTÕES SOBRE O TRABALHO PRÁTICO 1. As células foram cultivadas a 37º C com agitação até se atingir a A 540 de 0,5. Explique porque razão a estirpe foi cultivada nesta condições experimentais e sem antibiótico e até este valor de absorvância justificando a sua resposta. 2. As células foram ressuspendidas em CaCl 2. Explique o papel deste composto químico na preparação de células competentes justificando a sua resposta. 3. As células competentes foram conservadas em glicerol. Explique o papel deste composto químico na conservação de células competentes justificando a sua resposta. papel Preparação de Células Competentes de Escherichia coli HB101 Página 14

6 BIBLIOGRAFIA 1. Boyer, H.W., Roulland-Dussoix, D. (1969) A complementation analysis of the restriction and modification of DNA in Escherichia coli. J Mol Biol. 41, Brown, T.A. (2010) Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction. 6 th edition, Wiley- Blackwell, West Sussex, UK. 3. Hanahan, D. (1985) Techniques for transformation of E. coli. In DNA cloning: A Practical Approach (ed. D.M. Glover), vol. 1 pp IRL Press, Oxford, UK. 4. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. (1990) High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96(1), Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2 nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA. 6. Seidman, C.E., Struhl, K., Sheen J., Jessen T. (1997) Introduction of Plasmid DNA into Cells. Curr. Protoc. Mol. Biol. 37: Videira, A. (2011) : Princípios e aplicações. 2.ª edição, Edições LIDEL, Lisboa, Portugal. Preparação de Células Competentes de Escherichia coli HB101 Página 15