5 Aula Prática Exame do Microcultivo de levedura. Plaqueameno de Açúcar. Ensaio de Óxido-Redução com Resazurina

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1 IB UNESP - Rio Claro CCA - UFSCar Araras II CURSO DE MONITORAMENTO DA FERMENTAÇÃO ETANÓLICA PERÍODO: 11 a 15 DE FEVEREIRO DE 2008 ATIVIDADES PRÁTICAS 5 Aula Prática Exame do Microcultivo de levedura. Plaqueameno de Açúcar. Ensaio de Óxido-Redução com Resazurina 1 OBJETIVO: 1.1 Verificar microscopicamente a organização celular do crescimento da levedura; 1.2 Verificar a técnica de contagem de bactérias presentes no açúcar; 1.3 Proceder uma avaliação relativa de prováveis contaminantes (água de lavagem da cana, caldo de contato, mosto, xarope, mel, antes e após o trocador de calor). 2 MATERIAL: Placa com lâmina de microcultivo; Placa de Petri com meio Plate Count Agar (PCA); Tubo com solução de açúcar cristal para verificação da contaminação; Fósforo; Alça de Drigalsky; Microscópio; Tubo com material contaminado (água ou mel diluído); 3 tubos com resazurina (indicador de óxido-redução); Papel absorvente; Becker com etanol; Pipetas esterilizadas de 1 ou 2 ml; 1

2 Bico de Bunsen; Frasco para descarte das pipetas; Material para assepsia da bancada; Caneta de retroprojetor. Material para assepsia; 3 PROCEDIMENTO: 3.1 Colocar a lâmina de microcultivo no microscópio e começar a focalizar as culturas com o menor aumento. Cuidar para não quebrar a lamínula. Passar cuidadosamente para as de maiores aumentos. Verifique se há formação de células livres ou de pseudomicélio (células reunidas formando aglomerados ou ramificações). 3.2 Efetuar a verificação de contaminantes presentes no açúcar. Dada as exigências cada vez maiores da qualidade dos alimentos, o controle da quantidade de bactérias e fungos/leveduras está sendo solicitada. Para fins de treinamento será efetuado um plaqueamento em meio de cultura de contagem geral, o PCA. Nas indústrias empregam-se outros meios como o flat sauer que contém indicador e permite uma boa visualização das colônias. A solução de açúcar ou mel foi efetuada pesando-se separadamente 225 g do produto que foram dissolvidos em solução salina estéril. A seguir estas soluções foram distribuídas em tubos (para diferentes grupos). O plaqueamento será efetuado pela técnica de superfície colocando-se 0,1 ml da solução no centro da placa contendo o meio. A seguir espalhar com a alça de Drigalsky, incubar as placas na posição invertida durante horas. Contar as unidades formadoras de colônias. 2

3 Exemplo de cálculo: 25 g foram dissolvidos em 225 ml e considerando-se o volume de açúcar, completa-se 250 ml. Assim: 25,0 g 250 ml 20,0 g 200 ml 10,0 g 100 ml 1,0 g 10 ml 0,1 g 1 ml 0,01 g 0,1 ml Se crescerem 10 colônias e foram colocadas 0,1 ml da solução, pode-se calcular que: 10 colônias estão em 0,1 ml ou em 0,01 g de açúcar ou mel 100 colônias estão em 1,0 ml ou em 0,1 g de açúcar ou mel 1000 colônias estão em 10,0 ml ou em 1,0 g de açúcar ou mel Cada comprador de açúcar exige um padrão microbiológico 3.4 Análise de bactérias esporulantes termófilas aeróbias totais e diferencial para termófilas flat-sour Meio DTA (GTA) Triptona 10,0 g Dextrose 5,0 g Púrpura de Bromocresol 0,04 g (4 ml de uma solução 1%) H 2 O destilada 1000 ml Ajustar o ph para 6,7 Esterilizar a 1 atm (121 ºC) durante 15 min. 3

4 Preparo de solução de púrpura de bromocresol: Pesar 0,1 g de púrpura de bromocresol. Dissolver em 1,9 ml de NaOH 0,1N e completar o volume com água destilada até 10 ml. Meios equivalentes: Dextrose triptona agar (Difco 0080) Dextrose triptona agar (oxoide CM75) Dextrose triptona agar (BBL 11175) 3.5 Meio Dicloran Rosa Bengala Cloranfenicol (DRBC) Meio seletivo para isolamento de bolores e leveduras. Peptona 5,0 g Glicose 10,0 g KH 2 PO 4 1,0 g MgSO 4 0,5 g Dicloran 0,002 g Rosa Bengala 0,025 g Cloranfenicol 0,001 g Agar 15,0 g H 2 O destilada 1000 ml ph 5,6 Preparo: Dissolver os componentes e esterilizar a 121 ºC durante 15 min incluindo o cloranfenicol (cloranfenicol pode ser substituído por gentamicina 50 mg/l). Proteger o meio contra luz que fotodegrada o rosa bengala, que forma compostos inibidores de fungos e leveduras. Existe a marca comercial DRCB- Oxoid Para análise das bactérias esporuladas (esporos) pode aplicar o choque térmico; pesa-se 20 g de açúcar (se líquido verificar o peso equivalente), transfere-se para um erlenmeyer, dissolve-se até o volume de 4

5 100 ml aquece-se até a fervura por 5 minutos. Resfria-se e se necessário reponha o volume evaporado com água esterilizada. Após o choque térmico distribuir 10 ml da solução em 5 placas de Petri esterilizadas (2 ml por placa). Verter cerca de 20 ml d meio DTA sobre o inóculo, homogeneizando. Após solidificação incubar a 55 ºC durante horas. Padrão geral: Resolução ANVISA RDC 12/02/ Teste da Resazurina Preparar uma solução de NaCl 9 g/l, ajustar o ph a 7,0 com solução de NaOH. Solução de resazurina a 10 mg/l de solução de NaCl 9,0%. A solução não deve ser estocada por muito tempo (10 dias), e deve ser protegida da luz e de altas temperaturas. Preparar tubos com 9 ml de solução de resazurina, tampar com algodão, autoclavar por 10 minutos a 121 ºC. Nos tubos com resazurina, adicionar 1 ml da amostra. Incubar em estufa ou banho-maria a 37 ºC. Anotar as mudanças de cor a cada 30 minutos (violetaróseo-incolor), estão em relação direta com a atividade microbiana. Modificação da cor (horas) Avaliação da Infecção Tratamento violeta róseo Incolor - 0,5 3,0 Alta Imediato 0,5 2,0 4,0 Alta Imediato 1,0 4,0 6,0 Média Imediato 3,0 5,0 7,0 Fraca Normal 3,0 5,0 - desprezível Preventivo 5

6 Anotações Pessoais: 6