INFLUÊNCIA DO ph NA PRODUÇÃO DE ETANOL POR Pichia stipiti

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1 INFLUÊNCIA DO ph NA PRODUÇÃO DE ETANOL POR Pichia stipiti Juliana Cristina A. Cabral 1, João Paulo A. Silva, Inês C. Roberto 3 1,,3 Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo, Departamento de Biotecnologia. Estrada Municipal do Campinho s/n, Lorena - SP, CEP 1-, july@alunos.eel.usp.br; joaopaulo@debiq.eel.usp.br; ines@debiq.eel.ups.br Resumo- Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do ph inicial sobre a produção de etanol a partir da xilose pela levedura Pichia stipitis NRRL-Y-71. Os estudos foram realizados em frascos Erlenmeyer de ml com ml de meio de fermentação com a seguinte composição (g/l): xilose (3,); extrato de levedura (3,); MgSO. 7H O (1,); (NH ) HPO (3,). O ph inicial do meio foi ajustado de 3 a 7. Os frascos foram incubados em agitador rotatório a 3 C, d e agitação por h. Os resultados revelaram que a melhor faixa de ph para o processo de bioprodução de etanol foi entre e, onde obteve as maiores concentrações de etanol (em torno de 1, g/l). Nestas condições, os valore de produtividade volumétrica em etanol e de fator de conversão de substrato em produto foram de, g/l.h e, g/g, respectivamente. Palavras-chave: Pichia stipitis NRRL-Y-71, xilose, ph, fermentação. Área do Conhecimento: Ciências Biológicas. Introdução O estudo da produção de etanol por fermentação tem ganhado importância devido ao aumento na demanda nos últimos anos como combustível automotivo e como complemento para gasolina (Ratnam et al., ; Sun e Cheng, ). Além de ser uma fonte de energia renovável, o etanol apresenta outras vantagens sobre a gasolina, por ser um combustível oxigenado que contém 3% de oxigênio, o que reduz a emissão de NO x e materiais particulados oriundos da combustão. O uso de etanol produzido por fermentação como combustível não contribui para o aumento líquido de dióxido de carbono na atmosfera, já que é produzido a partir de matérias primas renováveis que seqüestram CO da atmosfera (Demirbas, ; Nilsson, ). Os materiais lignocelulósicos têm sido apontados como uma promissora fonte de matéria prima para processos de bioconversão, dentre eles a produção de etanol (Lin e Tanaka, ). A xilose é o principal açúcar obtido na hidrólise da fração hemicelulósica de resíduos agrícolas e madeira duras, sendo sua bioconversão um passo importante na utilização destes materiais (Nakamura; Sawada; Inoue, 1; Guo et al., ). A capacidade de microrganismos em produzir etanol a partir de xilose tem sido investigada por muitos pesquisadores (Sanchez, ; Millati; Edebo; Taherzadeh, ; Hahn-Hägerdal, 199). Em diversos trabalhos, Pichia stipitis tem apresentado resultados promissores na conversão de xilose em etanol a partir de hidrolisados de biomassa lignocelulósica (Nigam, 1; Agbogbo, ). As condições ambientais do processo como ph, temperatura, oxigênio e a composição do meio de cultura são fatores importantes, capazes de influenciar fortemente a produtividade de qualquer processo de bioconversão (Sunitha et al., 1999). Nos processos de bioconversão o ph é um importante fator, sendo capaz de exercer grande influência sobre a produção de etanol a partir da xilose como reportado por Du-Preez (199). O ph ótimo de fermentação pode variar devido aos diferentes meios de fermentação empregados, condições de cultivo ou ainda diferentes cepas. Por isso é importante determinar a melhor faixa de ph para um determinado processo fermentativo. Dentro deste contexto, o presente trabalho tem como objetivo avaliar a influencia do ph na produção de etanol a partir de xilose, pela levedura Pichia stipitis em frascos agitados. Metodologia Os experimentos foram realizados no Departamento de Biotecnologia Industrial da Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo. Processo Fermentativo: O microorganismo utilizado foi a levedura Pichia stipitis NRRL-Y- 71. O inoculo foi preparado em frascos Erlenmeyer de ml contendo ml de meio de cultivo composto por (g/l): xilose (3,); extrato de levedura (3,); MgSO. 7H O (1,); (NH ) HPO (3,). Os fracos foram inoculados com 1 ml de suspensão celular, resultante da transferência de duas alçadas da levedura Pichia stipitis, cultivada em ágar malte, para ml de água estéril. Os frascos foram incubados em agitador rotatório a 3 C e rpm por h. Após o cultivo as células foram centrifugadas, lavadas com água destilada 1

2 estéril, e ressuspensas na metade de seu volume original. A concentração celular desta suspensão foi quantificada por espectrofotometria a fim de se determinar o volume a ser utilizado como inoculo. A fermentação foi conduzida em frascos Erlenmeyer de ml, com ml de meio de cultivo contendo em g/l: xilose (3,); arabinose (1,); glicose (3,); extrato de levedura (3,); MgSO.7H O (1,); (NH ) HPO (3,). O ph inicial do meio foi ajustado com HCl (N) de forma a obter valores iniciais de 3 a 7. Os frascos foram inoculados com 1 g/l de células e incubados em agitador rotatório a 3 C e rpm. Acompanhamento Analítico dos Processos: O acompanhamento analítico das fermentações foi realizado retirando-se amostras periodicamente para determinação de açúcares (glicose, xilose, arabinose), etanol, concentração celular e acompanhamento do ph. A concentração celular foi determinada pela medida das absorbâncias das amostras diluídas em espectrofotômetro Hitachi U1 a nm tendo água destilada como branco. Os valores de concentração foram calculados através da equação das curvas de calibração entre o peso seco e absorbância, obtidas para o microrganismo em estudo. As concentrações de D-glicose, D-xilose, L- arabiose, ácido acético e etanol foram determinadas por Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC), em equipamento Waters equipado com detector de índice de refração e coluna BIORAD Aminex HPX-7H (3 X 7, mm), nas seguintes condições: temperatura de C; eluente: ácido sulfúrico,1 N; fluxo de, ml/min; volume de amostra de µl.. Para identificação dos picos obtidos no cromatograma, foram determinados os tempos de retenção dos açúcares e do etanol e a quantificação foi realizada através de curvas de calibração. Resultados Os resultados das fermentações da levedura Pichia stipitis nos diferentes valores de ph avaliados estão apresentados na Figura 1. Observa-se que a levedura foi capaz de produzir etanol em todos os valores de ph estudado. Notase ainda que em todas as condições avaliadas a arabinose não foi consumida pela levedura, sendo assim as concentrações de substrato nas cinéticas das fermentações foram baseadas na soma das concentrações de glicose e xilose. Verifica-se que nos ensaios com o ph inicial de,;,1 e,9 o substrato foi totalmente consumido após o tempo de h de fermentação, enquanto que nos valores de ph inicial 3, e,17, observa-se um residual de substrato de, e g/l, respectivamente, que permanecem até h. A Figura 1 também mostra que para todas as condições estudadas, ocorreu uma queda do ph com o tempo da fermentação. Para os ensaios de ph 3,;,17 e, os valores decresceram para, após h. Para os ensaios realizados em ph inicial,1 e,9, os valores deste parâmetro decresceram para 3, e,, respectivamente, em h e continuou caindo até atingir valores próximos a, no tempo de h. Em todas as condições experimentais avaliadas, a concentração celular máxima foi maior com o aumento do ph inicial o que demonstra que na faixa de ph avaliada (3, a,9) o aumento do ph favoreceu o crescimento celular. A concentração máxima de células foi de 9, g/l em ph,9. Com relação a produção de etanol, nota-se que a concentração máxima obtida foi próxima de 1 g/l em h nos ensaios com o ph inicial de,17;,;,1 e,9. Após este tempo, para os ensaios com o ph inicial de,17;,1 e,9 foi observado uma discreta redução da concentração de etanol, quando comparados ao de ph,. Neste último (ph,) ocorreu um aumento da ordem de % depois de h. Para o ph inicial de 3, verifica-se uma menor produção máxima de etanol (, g/l) provavelmente devido a queda acentuada de ph em h (,) o que prejudica o consumo de substrato pela levedura. Na Figura estão apresentadas os valores dos parâmetros fermentativos (conversão de substrato em etanol, Y P/S, conversão de substrato em células, Y X/S, produtividade volumétrica em etanol, Q P ) obtidos durante o cultivo de Pichia stipitis em xilose com diferentes valores de ph inicial. Notase que a maior conversão do substrato em etanol, cerca de,1 g/g, foi obtido em ph inicial de 3, (Figura a), entretanto, neste ensaio foi observada a menor produtividade volumétrica em etanol,,31 g/l.h, (Figura c), o que se deve ao baixo consumo de substrato ocorrido nestas condições. Nos ensaios com o ph inicial de,9, foi observada a menor conversão em etanol,,7 g/g, (Figura a) e a maior conversão em células,, g/g, (Figura 1b). Estas resultados mostram que o aumento do ph, teve um efeito negativo sobre a conversão em produto, e um efeito positivo sobre a conversão em células. Conforme mostrado na Figura c. as maiores produtividades em etanol foram obtidas na faixa de ph entre e, sendo esta faixa de ph, dentro a região experimental estudada, a que apresentou os melhores resultados para a produção de etanol pela levedura Pichia stipitis.

3 1 ph 3, 3 1 ph, Tempo(h) ph, 3 1 ph, ph, Figura 1 - Acompanhamento cinético do crescimento de células ( ), consumo de substrato ( ), variação do ph ( ) e produção de etanol ( ). 3

4 Yx/s (g/g) Yp/s (g/g),,,3,3,,,1,,,,,,1,,, (a) ph 3, ph,17 ph, ph,1 ph,9 (b) ph 3, ph,17 ph, ph,1 ph,9 Discussão Resultados semelhantes ao encontrados neste trabalho, faixa ótima de ph para a produção de etanol pela levedura Pichia stipitis entre e, foram também reportados por Du-Preez (199) e Slininger e Bothast (199). De acordo com Du- Preez (199) o rendimento em etanol pela levedura Pichia stipitis CBS 71 foi fortemente afetado por variações de ph entre, e,, sendo o ph ótimo entre, e,. Slininger e Bothast (199) relataram que para fermentação de xilose por Pichia stipitis NRRL Y-71 a faixa de ph ótimo encontra-se entre e 7, não sendo, nesta faixa, observada grande influência da variação do ph sobre os parâmetros fermentativos. Segundo estes autores o ph, o mais recomendável, por minimizar a possibilidade de contaminação. Resultados semelhantes também foram descritos por Roberto et al. (199), durante a fermentação de xilose por Pichia stipitis onde a variação do ph inicial entre, e, exerceu pouca influência sobre os parâmetros fermentativos avaliados, obtendo-se nesta faixa valores de Y P/S entre,3 e,37 g/g, Y X/S entre,11 e,1 g/g e produtividades em torno de,9 g/l.h. É importante salientar que pode haver variações entre os valores ou faixas de ph ótimo, devido aos diferentes meios de fermentação empregados, condições de cultivo ou ainda diferentes cepas. Qp (g/l.h),,,,,3,3,,,1,,, (c) ph 3, ph,17 ph, ph,1 ph,9 Conclusão Os ensaios demonstram que a levedura Pichia stipitis NRRL-Y-71 foi capaz de produzir etanol na faixa de ph estudado, de 3 a 7. A maior produtividade volumétrica em etanol foi obtida para a região de ph inicial entre e. Abaixo do ph, a levedura produziu uma menor concentração de etanol mesmo com um valor conversão de substrato em produto semelhante aos demais ensaios, o que se deve ao menor consumo de substrato nestas condições. Acima do ph obteve-se uma menor conversão de substrato em etanol, devido ao desvio para a produção de células. Agradecimentos CNPq, FAPESP, CAPES. Figura : (a)-fator de conversão de substrato em etanol, (b)-fator de conversão de substrato em células, (c)-produtividade volumétrica em etanol.

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