MEIOS DE CULTURA PARA LEVEDURAS

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1 MONITORAMENTO TEÓRICO E PRÁTICO DA FERMENTAÇÃO ETANÓLICA MEIOS DE CULTURA PARA LEVEDURAS COORDENADORES: Profa. Dra. Dejanira Franceschi de Angelis Prof. Dr. Octávio Antonio Valsechi RIO CLARO 2006

2 MEIOS DE CULTURA PARA LEVEDURAS Profa. Dra. Maria Cecília F. Leite de Oliveira Profa. Dra. Dejanira de Franceschi de Angelis OBJETIVO: Desenvolvimento de técnicas microbianas que possibilitem a identificação da presença de bactérias contaminantes e leveduras diferentes daquelas usualmente empregadas (Saccharomyces cerevisiae e S. uvarum) na fermentação etanólica. 1. MEIO WLN 1.1. Preparo do meio WLN Plaqueamento Introdução sobre a finalidade: - o que é meio de cultura - característica principal dos meios verde de bromocresol - necessidade de antibiótico - o que permite avaliar: a) número total de células b) diferenças morfológicas entre colônias c) produção de ácido - possibilidade de tornar o meio parcialmente seletivo pela adição de actidiona - o que é actidiona - níveis de inibição sobre algumas leveduras 1.2. Preparo do meio Composição do WLN-modificado (quantidade para 100mL): Glicose... 5,0000g KH 2 PO ,0550g (a) KCl... 0,0425g (b) CaCl 2.2H 2 O... 0,0125g (c) MgSO 4.7H 2 O... 0,0125g (d) FeCl 3.6H 2 O... 0,2500g (e) MnSO 4.4H 2 O... 0,2500g (f) Peptona de caseína ,5000g Extrato de levedura... 0,4000g Ágar... 2,0000g Verde de bromocresol... 0,0022g (g) Ácido nalidíxico... 5,0000mg (h) Ampicilina... 5,0000mg (i) ph = 5,5 (HCl, 1 N)

3 Observação: os ingredientes a, b, c, d, e, f, g, h e i serão adicionados na forma de solução. a) Solução de KH 2 PO 4 5,5 g/ 100 ml. Usar 1 ml para 100 ml de meio. b) Solução de KCl 4,25 g/ 100 ml. Usar 1 ml para 100 ml de meio. c) Solução de CaCl 2.2H 2 O 1,25 g/ 100 ml. Usar 1 ml para cada 100 ml de meio. d) Solução de MgSO 4.7H 2 O 1,25 g/ 100 ml. Usar 1 ml para cada 100 ml de meio. e) Solução de FeCl 3.6H 2 O 0,5 g/ 200 ml. Usar 0,1 ml para cada 100 ml de meio. f) Solução de MnSO 4.4H 2 O 0,5 g/ 200 ml. Usar 0,1 ml para cada 100 ml de meio. g) Verde de bromocresol 220mg/ 100 ml. Dissolver em 5 ml de álcool e completar para 100 ml com água. Usar 1 ml para cada 100 ml de meio Procedimento a) Pesar a glicose em um becker. Coletar água em um becker (1/10 do volume total do meio, isto é, 10 ml) e acrescentar a glicose. Dissolver. Transferir para o tubo. Etiquetar glicose 5 g/ 10 ml para 100 ml de WLN. Esterilizar, após fechar com tampão e folha de alumínio. b) Coletar 83 ml de água destilada em um becker, acrescentar a peptona de caseína, extrato de levedura e as soluções. Dissolver em banho-maria, medir ph e ajustar com HCl 1N, se necessário. Acrescentar o ágar e voltar ao banho-maria. Após a dissolução, transferir para erlenmeyer de 250 ml e etiquetar WLN sem glicose. Fechar com tampão de algodão e folha de alumínio. Esterilizar 10 minutos a 1 atmosfera (121 o C) Uso de antibiótico e preparação das soluções Para minimizar o crescimento bacteriano que prejudicaria os resultados, o meio WLN sofre a adição de antibióticos. Na rotina dos laboratórios III e IV do Departamento de Bioquímica e Microbiologia do Instituto de Biociências sa UNESP-Rio Claro, verificou-se a eficiência da combinação do antibiótico ácido nalidíxico com ampicilina. a) Preparo da solução de ácido nalidíxico (Solução h)

4 Triturar 1 comprimido de 500 mg de ácido nalidíxico farmacêutico em almofariz. Dissolver a solução de NaOH 0,05N completando o volume para 100 ml. Guardar em geladeira. Usar 1 ml para cada 100 ml de meio de forma a obter 50 ppm (50 microgramas/ mililitro). A solução de ácido nalidíxico é autoclavável, podendo ser acrescentado ao meio antes da esterilização. b) Preparo da solução do antibiótico ampicilina (Solução I): Triturar 1 comprimido de 500 mg de ampicilina (farmacêutica) num almofariz. Dissolver em água destilada, completando o volume para 100 ml. Usar 1 ml para 100 ml de meio, de forma a obter a concentração final de 50 ppm (50 microgramas/ mililitro). Pode ser autoclavado. 2. MEIO WLN SEM BROMOCRESOL A preparação é idêntica à descrita em e 1.2.2, exceto que não se acrescente o verde de bromocresol. 3. MEIO WLN COM ACTIDIONA O meio WLN pode sofrer a adição de actidiona a um nível suficiente para inibir o crescimento de leveduras de processo e permitir o desenvolvimento daquelas espécies presentes que tenham menor sensibilidade ao produto. Vale lembrar que algumas espécies de leveduras são insensíveis a 1000 ppm. A actidiona inibe Saccharomyces cerevisiae e S. uvarum nas concentrações de 2,5 e 0,17 ppm. Por medida de segurança, trabalha-se com 5 ppm de actidiona. Preparação da solução de actidiona A actidiona deve ser manipulada com máxima cautela, com o objetivo de evitar sua ingestão ou contato com a pele. Solução estoque A: Pesar 0,2 g e dissolver em 1 ml de acetona. Juntar 9 ml de água e esterilizar por filtração em membrana millipore GSWP-01300, 0,22 micrometros. Essa solução terá a concentração de 20 mg/ ml. Guardar em geladeira.

5 Solução de trabalho B: Transferir 5 ml da solução A e adicionar 95 ml de água destilada estéril. A solução de trabalho terá a concentração de 1mg/ ml. Usar 0,5 ml para cada 100 ml de meio já esterilizado e fundido. Guardar em geladeira. 4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA Toma-se um volume medido da amostra (por exemplo, 10 ml). Centrifuga-se com assepsia, ressuspende-se em 9 ml de solução salina estéril. Após nova centrifugação, o sobrenadante é descartado e a massa celular é ressuspensa em salina de forma a se reconstituir o volume inicial da amostra. A suspensão sofrerá diluição em série até O plaqueamento em meio WLN sem actidiona é feito em duplicata, nas diluições 10-5, 10-6 e O plaqueamento nos demais meios é feito nas diluições 10-1, 10-2 e Observação: a prática de cada laboratório indicará as melhores diluições. 5. PLAQUEAMENTO Plaquear em superfície 0,1 ml de suspensão de células por placa, espalhando com espátula de Drigalsky. Incubar em estufa a 28 o C e proceder às leituras de 2 a 5 dias. 6. MEIO DE LISINA 6.1.Introdução sobre a finalidade do uso - característica principal do meio de lisina - necessidade de antibiótico - o que permite avaliar 6.2. Preparo do meio 2.1. Composição do meio de lisina modificado (para 100 ml de meio) YCB (Yeast Carbon Base)...1,17 g Lisina...0,10 g

6 Ágar...2,00 g Ampicilina...5,00 g Ácido nalidíxico...5,00 g Preparo do meio a) Preparo da solução YCB concentrada 10 vezes. Tomar 11,7 g de YCB e preparar 100 ml de solução concentrada 10 vezes, usando água morna. Esterilizar através de membrana millipore GSWP (0,22 micrômetros) e pré-filtro AP Esta quantidade é suficiente para preparar 1000 ml de meio. b) Preparo do meio sólido Dissolver 2,0 g de ágar e 0,1 g (100 ml) de lisina em 88 ml de água destilada em banhomaria. Adicionar 1 ml de solução de ampicilina e 1 ml de solução de ácido nalidíxico preparados como nos itens b. Autoclavar 10 minutos a 1 atmosfera (121 0 C). Após autoclavagem, adicionar assepticamente 10 ml da solução de YCB concentrada 10 vezes Preparo da amostra e plaqueamento Seguir instruções dos itens 4 e MEIO DE PRESERVAÇÃO DE LEVEDURAS 7.1.Meio Sólido de Sabouraud 4% - Peptona ou triptona...10 g - Glicose...40 g - Ágar...17 g - Água destilada ml Misturar os componentes e fundir em banho-maria. a seguir, distribuir em frascos ou tubos, tampar e esterilizar em autoclave por 10 minutos a 1 atmosfera (121 0 C). Observação: este meio pode ser preparado com 20 g de glicose.

7 7.2.Meio YEPD (Yeast Extract Peptone Dextrose) - Glicose...20 g - Peptona...20 g - Extrato de levedura...10g ou 20 ml de hidrolisado de levedura - Ágar...15 a 17 g - Água destilada ml Misturar os componentes, fundir em banho-maria e a seguir, distribuir em frascos ou tubos. Esterilizar durante 10 minutos a 1 atm de pressão. 7.3.Extrato de malte 2% - Extrato de malte...20 g -Ágar...15 a 17 g -Água destilada ml Dissolver em banho-maria o extrato de malte e o ágar. A seguir distribuir em frascos ou tubos, tamponar e esterilizar durante 15 minutos a 1 atm de pressão (121 o ) Foto 1: Leveduras de dorna cultivada no meio WLN com verde de bromocresol onde verifica-se diferentes biotipos.

8 Foto 2: Leveduras selvagens cultivadas em meio WLN com verde de bromocresol e actidiona, onde verifica-se diferentes biotipos. CONTAGEM DIRETA E DETERMINAÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR EM LEVEDURAS Os métodos de contagem direta são simples e rápidos, exigem um mínimode equipamento e permitem que seja observada simultaneamente, a morfologia celular. No controle da viabilidade celular na fermentação alcoólica, a coloração das células com azul de metileno ou eritrosina e o cultivo por plaqueamento são os mais empregados. A porcentagem e o número de células viáveis é determinado transferindo-se com uma pipeta de Pasteurs a mostra para a câmara de Neubauer. Trata-se de uma lâmina especial, precisamente dividida em quadrados de 1mm 2 de área; a lâmina é coberta com uma lamínula, que deixa um volume, sobre cada quadrado, de 10-4 cm 3 ou 0,1 mm 3 (equivalente a 1 ml).

9 Figura 1. Câmara de Neubauer