Departamento de Zoologia da Universidade de Coimbra

Transcrição

1 Departamento de Zoologia da Universidade de Coimbra MICROBIOLOGIA António Veríssimo Paula Morais Medição do crescimento de E. coli Fundamento A verificação do desenvolvimento das populações de E. coli no meio de cultura far-se-á através da determinação da sua densidade óptica (D.O.), ao longo do tempo. A determinação da densidade óptica, absorvência aparente ou opacidade, consoante a preferência dos autores, é o meio mais simples de inferir a concentração de biomassa de microrganismos unicelulares. A densidade óptica é, fundamentalmente, a quantidade de luz "espalhada" por uma suspensão de células. Esta técnica baseia-se no facto de pequenas partículas "espalharem" luz proporcionalmente (dentro de certos limites) à sua concentração; assim, quando um feixe de luz passa através de uma suspensão de bactérias, a redução na quantidade de luz transmitida é principalmente consequência do "espalhamento" originado pela massa bacteriana presente (Fig.1)

2 Esta diminuição de luz transmitida pode ser medida com um espectrofotómetro no entanto, o parâmetro a medir é dependente da geometria óptica do aparelho, por isso, deve ser usado um só aparelho e deve ter-se o cuidado de referenciar o modelo utilizado nas medições. Equipamento, meios de cultura e soluções Incubadora orbital com temperatura e agitação reguláveis -"shaker" Espectrofotómetro; "cuvettes" Pipetas estéreis Tubos de ensaio "Vortex" 1 frasco de 250 ml com 100 ml de MB 1 +glucose 0, 1%; estéril Inóculo - cultura de E. coli em fase estacionária Banho de gelo 50 ml de MB Composição do meio de cultura MB (Meio Base) Extracto de levedura 0,76 g KH 2 PO 4 15,10 g (NH 4 ) 2 SO 4 2,20 g MgSO 4. 7H 2 O 0,20 g FeSO 4. 7H 2 O 1 ml a 0,60% H 2 O 1000 ml Procedimento 1- Com uma pipeta estéril, inocular o meio de cultura com um dado volume de inóculo (cultura de E. coli em fase estacionária) de tal modo que, a D.O. inicial seja de aproximadamente 0,08. 1 O meio de cultura MB é esterilizado por autoclavagem a 121 C durante 15 minutos; enquanto que os hidratos de carbono devem ser esterilizados por filtração e adicionados ao meio depois da autoclavagem

3 2- Agitar suavemente a cultura, de modo a torná-la homogénea. 3- Usando pipetas estéreis, retirar 2,5 ml da cultura para um tubo de ensaio previamente colocado em gelo. 4- Colocar a cultura na incubadora e iniciar a incubação a 35 C e com agitação de 120 rot./min. 5- Ler a densidade óptica inicial da cultura num espectrofotómetro a 560 nm, utilizando como referência, para ajustar o zero, o meio de cultura sem bactérias. 6- De 20 em 20 minutos, contados a partir do início da incubação, retirar 2, em condições estéreis, 2,5 ml de amostra da cultura, para os respectivos tubos de ensaio colocados em gelo e ler a densidade óptica correspondente, como se indica em Parar a incubação quando se verifique que a cultura se encontra, claramente, em fase estacionária. Cálculo dos parâmetros matemáticos do crescimento O estudo do crescimento de uma população bacteriana homogénea, realizada nas condições descritas, resulta geralmente em três fases distintas. Uma fase inicial, onde não se verifica incremento da densidade bacteriana, denomina-se fase de latência e a taxa de crescimento é nula. Depois, verifica-se uma fase de crescimento propriamente dito em que existe um grande incremento na densidade bacteriana. Esse incremento é em função exponencial. Assim, esta fase adquire, geralmente, a designação de fase exponencial do crescimento; aqui a taxa de crescimento é constante e atinge o seu valor máximo e, em condições ambientais definidas, é uma característica da estirpe bacteriana. 2 As amostras da cultura devem ser retiradas o mais rapidamente possível para que, o tempo necessário a esta operação, não afecte o ritmo normal de crescimento das populações bacterianas. Para além disso, as amostras devem ser colocadas em tubos que se encontram em gelo e devem aí manter-se até ser determinada a D.O., garantindo assim que a amostra da cultura não se desenvolve no tubo de ensaio. Aquando da determinação da D.O., cada tubo deve ser agitado no "vortex" antes do seu conteúdo ser vertido para a "cuvette" do espectrofotómetro

4 Finalmente, a população bacteriana deixa de incrementar, por exaustão do meio de cultivo ou acumulação de elementos tóxicos e chega-se à fase estacionária, em que a cultura atinge um "steady state" isto é, a população mantém-se constante ao longo do tempo. Nesta fase a taxa de crescimento é, obviamente, nula. Se a incubação for prolongada assiste-se a uma fase de crescimento negativo em que há um decréscimo do número de células viáveis na população bacteriana; esta designa-se por fase de morte e a taxa de crescimento é negativa. Entre cada uma destas fases, nítidas, do crescimento ocorrem fases de aceleração e desaceleração do ritmo de crescimento, embora na prática, muito difíceis de observar. Quando a população bacteriana se encontra na fase de crescimento propriamente dito (fase exponencial), a taxa de incremento populacional em qualquer tempo particular é proporcional ao número de bactérias presentes nesse tempo. O incremento de células = µ (número de células); a constante de proporcionalidade µ é designada por taxa específica de crescimento ou, por vezes, por constante de crescimento. Esta relação pode ser traduzida matematicamente por: dn/dt=µn (massa celular, ou qualquer mesmo incremento) no tempo t. por integração, obtemos: lnn-lnn o =µ(t-t o ) sendo N o número de células outro parâmetro que obedeça ao em que N o é o número de células no tempo t o. de onde facilmente se conclui que: µ=lnn-lnn o /t-t o ou de outra forma µ=2,303(log 10 N-log 10 N o )/t-t o Sabendo µ, é possível predizer a relação exponencial entre o número de células na população e o tempo. N=N o e µ(t-t o ) ou N=N o 10 µ(t-t o )/2,

5 Outro importante parâmetro que define o crescimento bacteriano é o tempo de duplicação (g), também designado por tempo de geração. Representa o tempo necessário para que uma dada geração celular dê origem a uma geração completamente nova, por outras palavras, o tempo de duplicação é o tempo requerido para que todos os componentes da cultura sofram um incremento de um factor de 2. Assim, quando t-t o =g ; N=2N o <=> N/N o =2 como sabemos lnn-lnn o =µ(t-t o ) ou seja: ln(n/n o )=µ(t-t o ) quando t-t o =g, ln2=µg ou seja g=ln2/µ <=> g=0,6931/µ Procedimento 1- Determinar, por regressão linear, a recta óptima que corresponde à fase exponencial de crescimento. 2- Determinar o declive da recta pois corresponde à taxa específica de crescimento Determinar o tempo de geração por intermédio da fórmula respectiva. 3 Deve ter-se o cuidado de no cálculo do declive utilizar os valores de ln D.O., pois só assim, estaremos em presença de uma recta, uma vez que o crescimento representa uma função exponencial