Notas: Aprovado pelo Deliberação CECA nº 3 963, de 16 de janeiro de 2001, Publicada no DOERJ de 23 de janeiro de 2001.

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1 MF-405.R-4 - MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) DE COLIFORMES TOTAIS E FECAIS EM AMOSTRAS DE CORPOS D ÁGUA OU DE EFLUENTES DE ESTAÇÕES DE TRATAMENTO DE ESGOTOS, PELA TÉCNICA DOS TUBOS MÚLTIPLOS Notas: Aprovado pelo Deliberação CECA nº 3 963, de 16 de janeiro de 2001, Publicada no DOERJ de 23 de janeiro de OBJETIVO Definir o método de determinação do número mais provável (NMP) de coliformes totais e fecais em amostras de corpos d'água ou de efluentes de estações de tratamento de esgotos, pela técnica dos tubos múltiplos. 2 DOCUMENTO DE REFERÊNCIA MN MANUAL DE AMOSTRAGEM DE QUALIDADE DE ÁGUA 3 DEFINIÇÕES Para efeito deste método são adotadas as seguintes definições: 3.1 BACILOS - Designação dada a certas bactérias que se apresentam sob a forma de bastonetes. 3.2 COLORAÇÃO DE GRAM - Coloração diferencial através da qual as bactérias são classificadas em Gram-positivas e Gram-negativas, dependendo da retenção ou não do corante cristal violeta. 3.3 ESPOROS - Corpúsculos esféricos ou ovóides que se formam em certas bactérias mais resistentes aos efeitos do calor, dessecação, congelamento, drogas deletérias e radiações do que as próprias células que os formam. 3.4 COLIFORMES TOTAIS (GRUPO COLIFORME) - Bacilos Gram-negativos, não formadores de esporos, aeróbicos ou anaeróbicos facultativos, que fermentam a lactose com produção de gás e ácido dentro de 48 horas a 35 (+ 0,5) ºC. Neste grupo estão incluídos 4 (quatro) gêneros da família Enterobacterisceae: Escherichia, Klebsiella, Citrobacter e Enterobacter. 3.5 COLIFORMES FECAIS (COLIFORMES TERMO-TOLERANTES) - Coliformes capazes de se desenvolver e fermentar a lactose com produção de gás e ácido em 24 horas a 44,5 (+ 0,2) ºC. O principal componente desse grupo é a Escherichia coli.

2 3.6 NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) - Estimativa da densidade de bactérias em uma amostra, calculada a partir da combinação de resultados positivos e negativos, obtidos mediante a técnica dos tubos múltiplos. 3.7 CALDO LACTOSADO (C.L) - Meio de enriquecimento no qual as concentrações de lactose e peptona fornecem condições ótimas para o crescimento de bactérias do grupo coliforme. 3.8 CALDO LAURIL TRIPTOSE (CLT) - Meio de enriquecimento para bactérias do grupo coliforme em que o lauril sulfato de sódio atua como agente seletivo, com supressão do crescimento de bactérias esporuladas produtoras de gás, reduzindo a ocorrência de resultados falso-positivos no ensaio presuntivo para detecção de coliformes. 3.9 CALDO LACTOSADO VERDE BRILHANTE BILE (C.L.V.B.B) - Meio seletivo em que se obtém a inibição de bactérias Gram-positivas e de esporulados fermentadores da lactose, permitindo desenvolvimento de bactérias do grupo coliforme MEIO DE ENSAIO CONFIRMATÓRIO (MEIO DE E.C) - Meio seletivo para detecção de coliformes fecais (termo-tolerantes), em que os sais biliares inibem o crescimento de formas esporuladas e de bactérias Gram-positivas. A incubação a 44,5 (+ 0,2) ºC impede o desenvolvimento de coliformes que não são de origem fecal. 4 PRINCÍPIO DO MÉTODO Este método é baseado no princípio de que as bactérias presentes em uma amostra de água podem ser separadas umas das outras por agitação, resultando em uma suspensão de células bacterianas individuais, uniformemente distribuídas na amostra original. 5 RESUMO DA TÉCNICA A técnica para a determinação do NMP de coliformes totais e fecais em amostras de corpos d'água ou de efluentes líquidos consiste na inoculação de volumes decrescentes de amostra (diluições decimais consecutivas) em meios de cultura adequados ao crescimento dos microorganismos pesquisados, sendo cada volume inoculado em séries de 5 tubos. A determinação do NMP de coliformes totais pela técnica dos tubos múltiplos requer dois ensaios: presuntivo e confirmatório. Em casos especiais pode ser acrescentado o ensaio completo.

3 5.1 ENSAIO PRESUNTIVO - Consiste na semeadura de volumes determinados de amostra de água em série de 5 tubos de C.L ou C.L.T que são incubados a 35 (+ 0,5) ºC durante 24 ou 48 horas, ocorrendo enriquecimento de organismos fermentadores da lactose, se presentes na amostra. A produção de gás a partir da fermentação da lactose é prova presuntiva positiva para a presença de bactérias do grupo coliforme. 5.2 ENSAIO CONFIRMATÓRIO - Consiste na inoculação, em tubos de C.L.V.B.B, para coliformes totais, ou em tubos de Meio de E.C., para coliformes fecais, de porções das amostras que apresentaram resultado positivo no ensaio presuntivo. 6 APLICABILIDADE Este método se aplica a amostras de corpos d'água e de efluentes líquidos, acondicionadas e preservadas de acordo com o MN INTERFERÊNCIAS Cloro residual e metais pesados, se presentes na amostra, podem levar a resultados falsos. O cloro residual deve ser neutralizado e os metais pesados quelados no momento da coleta. A temperatura da amostra e o tempo decorrido entre a coleta e a análise também podem interferir nos resultados. A temperatura da amostra deve ser mantida entre 4 e 10 ºC; até o início da análise, que deverá ocorrer, preferencialmente, dentro de 8 horas. 8 APARELHAGEM E MATERIAL 8.1 Os equipamentos e a vidraria necessários para a realização dos testes consistem de: Autoclave; Incubadora bacteriológica regulada para 35 (± 0,5) ºC; Banho-maria regulado para 44 a 46 ºC; Balança com precisão de 0,1 mg; Medidor de ph; Frascos para água de diluição; Tubos de ensaio; Tubos de Durhan; Pipetas tipo Mohr, de 5 ml e 10 ml; Alças de inoculação de níquel-cromo, platina-irídio ou platina; Estante para tubosde ensaio.

4 8.2 Todo material que entre em contato com a amostra deve ser quimicamente inerte, preferencialmente de vidro. 8.3 Todo o material deve ser esterilizado a seco, antes do uso. 9 REAGENTES E SOLUÇÕES 9.1 ÁGUA DESTILADA ESTÉRIL Água destilada autoclavada 9.2 SOLUÇÃO DE HIDRÓXIDO DE SÓDIO 1 N Pesar 40 g de hidróxido de sódio (NaOH) p.a, colocar em balão volumétrico e completar o volume para ml com água destilada estéril. Guardar em frasco apropriado. 9.3 SOLUÇÃO ESTOQUE A Dissolver 34,0 g de fosfato monobásico de potássio (KH 2 PO 4 ) p.a em 500 ml de água destilada estéril, em balão volumétrico, e ajustar o ph para 7,2 (± 0,1) com solução de hidróxido de sódio 1 N. Completar o volume para ml com água destilada estéril e colocar em frasco adequado. Guardar em geladeira. 9.4 SOLUÇÃO ESTOQUE B Dissolver 81,1g de cloreto de magnésio (MgCl 2.6H 2 O) p.a em ml de água destilada estéril. Colocar em frasco adequado e guardar em geladeira. 9.5 ÁGUA DE DILUIÇÃO FOSFATADA Pipetar 1,25 ml da solução estoque A e 5,0 ml da solução estoque B e diluir em água destilada estéril. Completar o volume a ml. Distribuir em frascos de diluição quantidades que assegurem, após autoclavação a 121 ºC, durante 20 minutos, volumes de 90 (± 2) ml. 9.6 MEIOS DE CULTURA Poderão ser utilizados os meios de cultura prontos, encontrados no comércio sob a forma de pó desidratado, ou então preparados no laboratório, a partir dos ingredientes-básicos que devem ser de alta pureza Caldo Lactosado de Concentração Dupla Pesar e transferir para béquer de 2litros os seguintes sais:

5 26,0 g do meio desidratado pronto ou pesar 6,0 g de extrato de carne; 10,0 g de peptona; e 10,0 g de lactose. Acrescentar ml de água destilada fria. Aquecer, agitando freqüentemente, até completa dissolução do meio, tomando cuidado para que não seja atingida a temperatura de ebulição. Em tubos de ensaio contendo no seu interior tubo de Durhan invertido, distribuir volumes adequados para que o volume final, após esterilização, seja de 10 ml. Tampar com algodão ou com cápsula de alumínio e esterilizar em autoclave a 121 ºC durante 15 minutos. ph final, após esterilização: 6,9 (± 0,1) a 25 ºC Caldo Lactosado. de Concentração Simples Pesar a metade das quantidades de reagentes do item anterior e seguir o mesmo procedimento descrito Caldo Lauril Triptose de Concentração Dupla Pesar e transferir para béquer de 2 litros os seguintes sais: 71,2 g do meio desidratado pronto ou pesar 40,0 g de triptose; 10,0 g de lactose; 5,5 g de fosfato dibásico de potássio (K 2 HPO 4 ) p.a; 5,5 g de fosfato monobásico de potássio p.a (KH 2 PO 4 ) p.a; 10,0 g de cloreto de sódio (NaCl) p.a; e 0,2 g de lauril sulfato de sódio (C 12 H 25 O 4 SNa) p.a. Acrescentar ml de água destilada fria. Aquecer, agitando freqüentemente, até completa dissolução do meio, tomando cuidado para que não seja atingida a temperatura de ebulição. Em tubos de ensaio contendo no seu interior tubo de Durhan invertido, distribuir volumes adequados para que o volume final, após esterilização, seja de 10 ml. Tampar com algodão ou cápsula de alumínio e esterilizar em autoclave a 121 ºC, durante 15 minutos. ph final, após esterilização: 6,8 (± 0,2) a 25 ºC Caldo Lauril Triptose de Concentração Simples Pesar a metade das quantidades de reagentes do item anterior e seguir o mesmo procedimento descrito Caldo Lactosado Verde Brilhante Bile a 2% Pesar e transferir para béquer de 2 L os seguintes sais: 40,0 g do meio desidratado pronto ou pesar 10,0 g de peptona;

6 10,0 g de lactose; 20,0 g de bile de boi desidratada; e 0,0133 g de corante verde brilhante. Acrescentar ml de água destilada fria. Aquecer, agitando freqüentemente, até completa dissolução do meio, tomando cuidado para que não seja atingida a temperatura de ebulição. Em tubos de ensaio contendo no seu interior tubo de Durhan invertido, distribuir volumes adequados para que o volume final, após esterilização, seja de 10 ml. Tampar com algodão ou cápsula de alumínio e esterilizar em autoclave a 121º C, durante 15 minutos. ph final, após esterilização: 7,2 (± 0,2) a 25º C Meio de E.C Pesar e transferir para béquer de 2 litros os seguintes sais: 7,0 g do meio desidratado ou pesar 20,0 g de triptose ou tripticase; 5,0 g de lactose; 1,5 g de mistura de sais biliares ou sais biliares nº 3; 4,0 g de fosfato dibásico de potássio (K 2 HP0 4 ) p.a; 1,5 g de fosfato monobásico de potássio (KH 2 PO 4 ) p.a; e 5,0 g de cloreto de sódio (NaCl) p.a. Acrescentar ml de água destilada fria. Aquecer, agitando freqüentemente, até completa dissolução do meio, tomando cuidado para que não seja atingida a temperatura de ebulição. Em tubos de ensaio contendo no seu interior tubos de Durhan invertidos, distribuir volumes adequados para que o volume final, após esterilização, seja de 5 ml. Tampar com algodão ou cápsula de alumínio e esterilizar a 121º C, durante 15 minutos. ph final, após esterilização: 6,9 (± 0,2) a 25 ºC. 10. ENSAIOS 10.1 ENSAIO PRESUNTIVO Preparar os tubos de C.L. ou CLT exigidos para o ensaio e dispô-los em estantes, em fileiras de 5 tubos (para inoculação de porções de 10 ml da amostra, usar o meio de concentração dupla) Proceder a marcação dos tubos, anotando o número designado pelo laboratório na ficha de registro de exames, o volume selecionado de amostra a ser inoculado e a data.

7 Homogeneizar a amostra, agitando vigorosamente o frasco Com uma pipeta esterilizada e obedecendo os cuidados de assepsia, transferir 10 ml da amostra para um frasco, contendo 90 (± 2) ml de água de diluição fosfatada, antecipadamente identificado. Prepara-se, assim, a primeira diluição decimal (10-1 ), sendo que 1 ml dessa diluição corresponde a 0,1 ml da amostra Com a mesma pipeta, semear 10 ml da amostra em cada um dos tubos de C.L ou CLT de concentração dupla, quando este for o volume requerido para o teste Com uma pipeta esterilizada, inocular 1 ml da amostra em cada um dos 5 tubos contendo 10 ml de C.L ou C.L.T de concentração simples Agitar vigorosamente o frasco contendo a primeira diluição (10-1 ) e com uma pipeta esterilizada transferir 10 ml para o frasco contendo 90 (± 2) ml de água de diluição fosfatada, tendo-se, assim, a segunda diluição decimal ( 10-2 ), sendo que 1 ml dessa diluição corresponde a 0,01 ml da amostra. Proceder da mesma maneira para as diluições desejadas 10-3, 10-4, etc..., conforme o grau de poluição da amostra Ordenar os frascos com as diluições desejadas, em ordem decrescente de concentração Agitar vigorosamente, 25 vezes, o frasco com a primeira diluição (10-1 ) e com uma pipeta estéril semear 1 ml da diluição em cada um dos tubos de C.L. ou C.L.T. de concentração simples, correspondente a essa diluição Proceder da mesma maneira nas diluições subseqüentes Após a inoculação de todos os volumes da amostra e/ou das diluições requeridas para o exame, colocar a estante contendo os tubos inoculados em estufa de cultura bacteriológica a 35 (± 0,5) ºC, durante 24 (± 2) horas Após esse período de incubação, retirar os tubos da incubadora para efetuar a primeira leitura dos resultados. Anotar na ficha de registro de exames quais os tubos que apresentaram resultado positivo, separando-os para a execução de ensaio confirmatório Retornar à incubadora os tubos com resultados negativos para um período adicional de 24 (± 1) horas, a 35 (± 0,5) ºC. Após esse novo período, os tubos com gás são anotados e separados e os negativos são desprezados ENSAIO CONFIRMATÓRIO

8 Todos os tubos positivos nas leituras de 24 (± 2) horas e 48 (± 3) horas do ensaio presuntivo são submetidos à confirmação. Para águas poluídas e residuárias pode-se ter o seguinte procedimento: nas leituras de 24 horas, submeter à confirmação a última série dos tubos correspondentes à maior diluição que apresentou todos os tubos com resultados positivos e os tubos das séries seguintes com resultados positivos. Desprezar as séries antecedentes considerando-se para os mesmos resultados confirmados positivos. No caso da leitura de 48 horas, confirmar todos os tubos presuntivos positivos Marcar os tubos de C.L.V.B.B e os do meio de E.C em número igual ao dos tubos de ensaio presuntivo que apresentaram resultado positivo Agitar cada tubo com resultado positivo e, com alça de inoculação, retirar o material e inocular nos tubos correspondentes de C.L.V.B.B e E.C., evitando a película superficial que se forma no ensaio presuntivo positivo Incubar os tubos de C.L.V.B.B inoculados durante 48 (± 3) horas a 35 (± 0,5) ºC, considerando positivos os tubos que, após esse período, apresentarem formação de gás no tubo de Durhan invertido. Anotar o resultado na ficha de registro de exames. l0.2.5 Incubar os tubos de Meio de E.C inoculados durante 24 (± 2) horas a 44,5(± 0,2) ºC, em banho-maria, no prazo máximo de 30 minutos após a inoculação. Proceder a leitura e considerar positivos os tubos que apresentaram formação de gás no interior do tubo de Durhan. Anotar o resultado na ficha de registro de exames. 11 RESULTADOS A densidade de coliformes é expressa em NMP por 100 ml da amostra. A estimativa do NMP/100 ml é feita através de consulta à Tabela de Número Mais Provável por 100 ml, computando-se os tubos positivos das 3 diluições consideradas críticas, isto é, aquelas em que há transição de tubos positivos para tubos negativos. Para selecionar as 3 diluições a serem usadas no cálculo, partir da maior diluição que apresentar todos os tubos positivos. Quando a tabela é aplicada considerando os tubos positivos do C.L.V.B.B, o resultado é expresso em coliformes totais por 100 ml de amostra. Quando é aplicada considerando os tubos de Meio de E.C, o resultado é expresso em coliformes fecais por 100 ml de amostras.

9 Exemplo: Volumes TUBOS POSITIVOS PARA CADA DILUIÇÃO Inoculados Amostra A Amostra B Amostra C Amostra D Amostra E 10 ml ml ml ml ml Ficar com os resultados seguintes nas amostras especificadas acima. Amostra A: = 110 coliformes/100 ml Amostra B: = 8000 coliformes/100 ml Amostra C: = 1700 coliformes/100 ml A amostra D não pode ser calculada, tendo que haver um reagrupamento dos tubos positivos resultando na amostra E: = 140 coliformes/100 ml. Notar que a tabela de NMP refere-se às inoculações de 10 ml, 1 ml e 0,1 ml. Quando diluições maiores são feitas, os resultados devem ser multiplicados pelo número de vezes que a amostra for diluída.

10 TABELA DE NÚMERO MAIS PROVÁVEL POR 100 ML Nº de tubos que apresentam reação positiva quando são utilizados Índice de NMP por Limites de confiança 95% 5 tubos de 5 tubos de 5 tubos de 100 ml Inferior Superior 10 ml 1 ml 0,1 ml

11 12 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 12.1 AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, Standard methods for the examination of water and wastewater, 16th ed. Washington, D.C., U.S.A. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY. Microbiological methods for monitoring the environment. Water and wastes. EPA 600/ , Cincinnati, December, KLABER, P. W.; CLARK, H.E. & GELDREICH, E.E. - Sanitary significance of coliform and fecal coliform organism in surface water. Public Health Reports, 79(1):57-60, 1964.