André Fioravante Guerra NMP/g ou ml de Coliformes a 35 e 45 C Valença, 1ª Edição, p. Disponível em:

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1 André Fioravante Guerra NMP/g ou ml de Coliformes a 35 e 45 C Valença, 1ª Edição, p. Disponível em:

2 çã NÚ MERO MAIS PROVA VEL (NMP/g ou ml) DE COLIFORMES A 35 E 45 C Coliformes não é especificamente um único microrganismo e sim um grupo de microrganismo definido como: Coliformes totais ou 35 C - bactérias da família Enterobacteriaceae, Gram negativos, em forma de bastonetes, oxidase negativos, não formadores de esporos, caracterizados pela presença da enzima ß-galactosidase e pela capacidade de fermentar a lactose com produção de gás em 48 horas à temperatura de 35 C em meios contendo sais biliares ou outros agentes tenso-ativos com propriedades inibidoras semelhantes. As bactérias mais frequentemente isoladas como coliformes totais são: Citrobacter, Enterobacter, klebsiella e Escherichia coli. Coliformes termotolerantes, fecais, 45 C - bactérias da família Enterobacteriaceae, Gram negativos, em forma de bastonetes, oxidase negativos, não formadores de esporos, pertencentes ao grupo dos coliformes totais e caracterizados pela presença da enzima ß-galactosidase e pela capacidade de fermentar a lactose com produção de gás em 24 horas à temperatura de 45 C em meios contendo sais biliares ou outros agentes tenso-ativos com propriedades inibidoras semelhantes. Quase sempre a bactéria isolada como coliforme fecal é Escherichia coli, porém há relatos que algumas cepas de klebsiella também podem pertencer a este grupo. A presença das bactérias deste grupo nos alimentos fornece evidência indireta sobre a qualidade da matéria prima, condições de processamento, condições do armazenamento e transporte ao qual este alimento foi submetido. Portanto, são análises que evidenciam indiretamente: Condições higiênicas o grupo responsável por indicar indiretamente as condições higiênicas ao qual o alimento foi submetido durante toda cadeia produtiva é o grupo dos coliformes totais. Condições higiênicas sanitárias além de evidências indiretas sobre higiene, também há evidências da possibilidade da veiculação de microrganismos patogênicos pelos alimentos. O grupo responsável por indicar indiretamente as condições higiênicas sanitárias é o grupo dos coliformes fecais.

3 NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP/g ou ml) DE COLIFORMES A 35 E 45 C EM ALIMENTOS A análise de coliformes pode ser realizada de várias formas. As duas mais usuais são: contagem em placas e técnica dos tubos múltiplos. Para cumprimento dos padrões exigidos na RDC n 12/2001, nesta apostila será contemplado a contagem de coliformes pela técnica de tubos múltiplos (NMP/g ou ml). Esta análise é realizada em duas etapas: fase presuntiva e fase confirmativa. 1 - FASE PRESUNTIVA Pesar 25 g ou pipetar 25 ml (alimentos líquidos) e adicionar 225 ml de diluente água peptonada a 0,1% ou diluente apropriado. Homogeneizar e preparar pelo menos mais duas diluições decimais transferindo 1 ml de cada diluição para tubos contendo 9 ml do mesmo diluente. De cada diluição, inocular alíquotas de 1 ml em série de três tubos contendo caldo lauril sulfato de sódio e tubo de Duhran para evidenciar a produção de gás. Incubar os tubos em estufa a 36 C por 48 horas. Os tubos positivos são evidenciados pela presença de gás no interior do tubo de Duhran devido fermentação da lactose com produção de ácido e gás. Todos os tubos positivos deverão ser confirmados como coliformes a 35 C ou coliformes 45 C. Obs - O caldo lauril sulfato de sódio contém uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante, impedindo a acidificação. A seletividade do meio é devido à presença do lauril sulfato de sódio, um agente surfactante aniônico que atua na membrana citoplasmática de microrganismos Gram positivos, inibindo o seu crescimento. FASE CONFIRMATIVA Coliformes a 35 C a partir dos tubos positivos da fase presuntiva, transferir uma alçada de cada tubo para outro contendo caldo verde brilhante lactose bile 2%. Incubar os tubos em estufa a 36 C por 48 horas. Os tubos positivos são evidenciados pela presença de gás no interior do tubo de Duhran devido fermentação da lactose com produção de ácido e gás. Obs - O caldo verde brilhante lactose bile 2% contém bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante), responsáveis pela inibição dos microrganismos Gram positivos.

4 Coliformes a 45 C - a partir dos tubos positivos da fase presuntiva, transferir uma alçada de cada tubo para outro contendo caldo Escherichia coli. Incubar os tubos em banho-maria a 45 ± 0,2 C por 24 horas. Os tubos positivos são evidenciados pela presença de gás no interior do tubo de Duhran devido fermentação da lactose com produção de ácido e gás. Obs - O caldo Escherichia coli contém uma mistura de fosfatos que lhe confere poder tamponante, impedindo a acidificação. A seletividade do meio se deve à presença de sais biliares, responsável pela inibição dos microrganismos Gram positivos e pela temperatura de incubação. EXPRESSÃO DE RESULTADOS Como trata-se de um método estatístico, o resultado deve ser expressado com auxílio de uma Tabela de Número Mais Provável. Especificamente neste caso, a Tabela utilizada deve ser a do Anexo 1. USO DA TABELA DE NÚMERO MAIS PROVÁVEL 1 Anotar o número de tubos positivos em cada diluição; 2 A quantidade de tubos positivos deve ser arranjados em uma única linha da maior para a menor diluição: Exemplo: Neste caso, a combinação de tubos a ser considerada é: Encontrar a combinação na Tabela de NMP. Exemplo: Número Mais Provável por grama ou ml, para séries de 3 tubos com inóculos de 0,1, 0,01 e 0,001 g ou ml e respectivos intervalos de confiança 95%. Número de Tubos Positivos NMP/g ou ml Intervalo de Confiança (95%) Inferior Superior <3, , , > Observar se a diluição utilizada para obter a combinação coincide com a diluição da Tabela NMP. 5 Se coincidir, o NMP expresso na quarta coluna da Tabela NMP já é o resultado. Caso contrário, o resultado da quarta coluna deve ser multiplicado pela razão (divisão) entre a diluição mais concentrada inoculada e a primeira diluição da Tabela NMP.

5 TABELA DE NÚMERO MAIS PROVÁVEL ELETRÔNICA (ALTERNATIVA) Alternativamente pode-se utilizar a Tabela NMP eletrônica disponível gratuitamente no site: Download: Tabela NMP-g ou ml. Série de 3 tubos. Inóculo 0,1; 0,01; 0,001 g. Valença, 1ª Ed Neste caso, deve-se digitar a combinação de tubos positivos após teste de confirmação em caldo verde brilhante ou Escherichia coli, e o resultado é gerado automaticamente. Também é necessário fazer a correção se a diluição mais concentrada utilizada para gerar o resultado não coincidir com a primeira diluição da Tabela NMP. Exemplo:

6 Há grande probabilidade dos coliformes a 45 C serem Escherichia coli, porém para se ter certeza disto, é necessário confirmar cada tubo pela série de teste do INVIC. A partir dos tubos positivos do caldo Escherichia coli: 1 Teste de produção de Indol transferir uma alçada para um tubo com água peptonada triptofano. Incubar em estufa a 36 C por 24 h, após adicionar algumas gotas de reativo de kovac s. Escherichia coli típica produz indol a partir do triptofano fazendo que a cor do tubo mude para vermelho ao adicionar reativo de kovac s. 2 Teste do vermelho de metila transferir uma alçada para um tubo com caldo MR-VP. Incubar em estufa a 36 C por 24 h, após adicionar algumas gotas de vermelho de metila. Escherichia coli típica produz ácido e consequentemente mudança de cor para vermelho quando adicionado indicador vermelho de metila. 3 Teste Voges-Proskauer transferir uma alçada para um tubo com caldo MR- VP. Incubar em estufa a 36 C por 24 horas, após adicionar 3-5 gotas de alfa-naftol e hidróxido de potássio a 40%. Escherichia coli típica não produz acetoína e não causa a mudança de cor do meio. 4 Teste do uso de citrato inocular uma alçada sobre a superfície inclinada do bisel de um tubo contendo ágar citrato de Simmon s. Incubar a 36 C por 24 horas. Escherichia coli típica não utiliza o citrato. Após confirmação dos tubos pela série de testes do INVIC, deve-se recalcular o resultado pela Tabela NMP e expressar o novo resultado como Escherichia coli. USO DA PLANILHA ELETRÔNICA NMP/g ou ml DE COLIFORMES A 35 E 45 C Download: Download: Tabela NMP-g ou ml de Coliformes a 35 e 45 C. Valença, 1ª Edição, Ao preencher o formulário inicial e selecionar a classe do alimento segundo RDC n 12/2001, automaticamente a planilha selecionará as diluições necessárias a serem inoculadas. Após fase confirmativa, deve-se preencher os campos com a quantidade de tubos positivos e a planilha calculará automaticamente sem a necessidade de fazer correção das diluições quando a diluição mais concentrada inoculada não coincidir com a primeira diluição da Tabela NMP. Caso desejar confirmar Escherichia coli deve-se selecionar sim no campo Confirmação Escherichia coli? Neste momento a planilha abrirá os campos com a série de Testes do INVIC. Ao preencher os resultados, automaticamente a confirmação de Escherichia coli será informada e o resultado NMP/ ou ml será calculado.

7 USO DA PLANILHA ELETRÔNICA NMP/g ou ml DE COLIFORMES A 35 E 45 C

8 Figura 1 NMP/g ou ml de coliformes a 35 e 45 C e confirmação de Escherichia coli.

9 ANEXO 1

10 ANEXOS 2 Figura 2 - Caldo Lauril Sulfato de Sódio Produção de gás devido fermentação da lactose. Figura 3 - Caldo Lauril Sulfato de Sódio. Crescimento de bactérias do grupo coliforme. Caldo Lauril Sulfato de Sódio Figura 4 Caldo Escherichia coli. Produção de gás devido fermentação da lactose. Figura 5 Caldo Escherichia coli. Crescimento de Escherichia coli

11 Figura 6 Caldo Verde Brilhante Lactose Bile 2%. Produção de gás devido fermentação da lactose. Figura 7 Caldo Verde Brilhante Lactose Bile 2%. Crescimento de bactérias do grupo coliforme. Ausência de indol (reativo de kovac s). Crescimento de Salmonella Typhimurium Detecção da produção de indol (reativo de kovac s). Crescimento de Escherichia coli. Figura 8 Ágar SIM. Produão de indol (Escherichia coli) e ausência de indol (Salmonella Typhimurium) prova produção de indol. Figura 9 Caldo MR-VP.

12 Figura 10 Caldo MR-VP. Crescimento de Escherichia coli após adição de vermelho de metila - prova vermelho de metila. Figura 11 Caldo MR-VP. Figura 12 Caldo MR-VP. Crescimento de Escherichia coli após adição de naftol e hidróxido de sódio a 40% - prova de Voges-Proskauer. Figura 13 Ágar Citrato de Simmons. Crescimento de Escherichia coli.

13 Figura 14 Ágar Citrato de Simmons. Crescimento de Salmonella Typhimurium.

14 ANEXO 3 Exemplo 1 Combinação de resultados Diluição utilizada Tubos positivos Combinação de tubos positivos Pela Tabela NMP/g = 150 NMP/g Exemplo 2 Combinação de resultados Diluição utilizada Tubos positivos Combinação de tubos positivos Pela Tabela NMP/g = NMP/g Exemplo 3 Combinação de resultados Diluição utilizada Tubos positivos Combinação de tubos positivos Pela Tabela NMP/g = <3,0 NMP/g Exemplo 4 Combinação de resultados Diluição utilizada Tubos positivos Combinação de tubos positivos Pela Tabela NMP/g = <0,3 NMP/g Exemplo 5 Combinação de resultados Diluição utilizada Tubos positivos Combinação de tubos positivos Pela Tabela NMP/g = >1100 NMP/g

15 BIBLIOGRAFIAS BRASIL. Resolução RDC n 12, de 2 de janeiro de Agência Nacional de Vigilância Sanitária ANVISA. Diário Oficial da União, BRASIL. Ministério da Agricultura. Instrução Normativa nº 62 de 26 de agosto de Oficializa os Métodos Analíticos Oficiais para Análises Microbiológicas para o Controle de produtos de Origem Animal e Água. Diário Oficial da União, FRANCO, Bernadette Dora Gombossy de Melo. Microbiologia dos alimentos. São Paulo: Atheneu, p., il. (Biblioteca biomédica). ISBN (Broch.). FORSYTHE, S.J. Microbiologia e Segurança Alimentar. Ed. ARTMED, 2002, 424 p. HARRIGAN, W.F. Laboratory Methods in Food Microbiology. 3rd. ed., 532 p. London: Academic Press, JAY, James M. Microbiologia de alimentos. 6.ed. Porto Alegre: Artmed, p., il. ISBN (Broch.). ISO 7251:2005. Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for the detection and enumeration of presumptive Escherichia coli -- Most probable number technique.