Notas: Aprovada pela Deliberação CECA nº 3 964, de 16 de janeiro de 2001 Publicada no DOERJ de 23 de janeiro de 2001

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1 MF-404.R-4 - MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) DE COLIFORMES TOTAIS EM AMOSTRAS DE ÁGUA DESTINADA AO CONSUMO HUMANO, PELA TÉCNICA DOS TUBOS MÚLTIPLOS Notas: Aprovada pela Deliberação CECA nº 3 964, de 16 de janeiro de 2001 Publicada no DOERJ de 23 de janeiro de OBJETIVO Definir o método de determinação do número mais provável (NMP) de coliformes totais em água destinada ao consumo humano, pela técnica dos tubos múltiplos. 2 DOCUMENTOS DE REFERÊNCIA MN MANUAL DE AMOSTRAGEM DE QUALIDADE DE ÁGUA. 3 DEFINIÇÕES Para efeito deste método são adotadas as seguintes definições: 3.1 BACILOS - Designação dada a certas bactérias que se apresentam sob a forma de bastonetes. 3.2 COLORAÇÃO DE GRAM - Coloração diferencial através da qual as bactérias são classificadas em Gram-positivas e Gram-negativas, dependendo da retenção ou não do corante cristal violeta. 3.3 ESPOROS - Corpúsculos esféricos ou ovóides que se formam em certas bactérias, mais resistentes aos efeitos do calor, dessecação, congelamento, drogas deletérias e radiações do que as próprias células que os formam. 3.4 COLIFORMES TOTAIS (GRUPO COLIFORME) - Bacilos Gram-negativos, não formadores de esporos, aeróbios e anaeróbios facultativos, que fermentam a lactose com produção de gás e ácido dentro de 48 horas a 35 ( 0,5) ºC. Neste grupo estão incluídos 4 gêneros da família Enterobacteriaceae: Escherichia, Klebsiella, Citrobacter e Enterobacter. 3.5 NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) - Estimativa de densidade de bactérias em uma amostra, calculada a partir da combinação de resultados positivos e negativos, obtidos mediante a técnica dos tubos múltiplos.

2 3.6 CALDO LACTOSADO (C.L) - Meio de enriquecimento no qual as concentrações de lactose e peptona fornecem condições ótimas para o crescimento de bactérias do grupo coliforme. 3.7 CALDO LAURIL TRIPTOSE (CLT) - Meio de enriquecimento para bactérias do grupo coliforme em que o lauril sulfato de sódio atua como agente seletivo, com supressão do crescimento de bactérias esporuladas produtoras de gás, reduzindo a ocorrência de resultados falso-positivos no ensaio presuntivo para detecção de coliformes. 3.8 CALDO LACTOSADO VERDE BRILHANTE BILE (C.L.V.B.B) - Meio seletivo em que se obtém a inibição de bactérias Gram-positivas e de especulados fermentadores da lactose, permitindo um bom desenvolvimento de bactérias do grupo coliforme. 4 PRINCÍPIO DO MÉTODO Este método é baseado no princípio de que as bactérias presentes em uma amostra de água podem ser separadas umas das outras por agitação, resultando em uma suspensão de células bacterianas individuais, uniformemente distribuídas na amostra original. 5 RESUMO DA TÉCNICA A técnica para determinação do NMP de coliformes totais em amostras de água destinada ao consumo humano consiste na inoculação de volumes de 10 ml da amostra, em cada um dos 5 tubos de meios de cultura adequados ao crescimento dos microorganismos pesquisados, constituindo cada um dos 5 tubos de 10 ml uma porção padrão e o conjunto deles uma amostra padrão. A determinação do NMP de coliformes totais pela técnica dos tubos múltiplos requer dois ensaios: presuntivo e confirmatório. 5.1 ENSAIO PRESUNTIVO Consiste na semeadura de volumes determinados de amostra de água em série de 5 tubos de C.L. ou C.L.T. que são incubados a 35 ( 0,5) ºC durante 24 ou 48 horas, ocorrendo enriquecimento de organismos fermentadores de lactose, se presentes na amostra. A produção de gás a partir da fermentação da lactose é prova presuntiva positiva para a presença de bactérias do grupo coliforme.

3 5.2 ENSAIO CONFIRMATÓRIO Consiste na inoculação, em tubos de C.L.V.B.B., de porções das amostras que apresentaram resultado positivo no ensaio presuntivo. 6 APLICABILIDADE Este método é aplicável unicamente às águas destinadas ao consumo humano, acondicionadas e preservadas de acordo com o MN INTERFERÊNCIAS O cloro residual presente na amostra pode levar a resultados falsos, devendo ser neutralizado no momento da coleta. A temperatura da amostra e o tempo decorrido entre a coleta e a análise também podem interferir nos resultados. A temperatura da amostra deve ser mantida entre 4 e 10 ºC até o início da análise, que deverá ocorrer, preferencialmente, dentro de 8 horas, ou no prazo máximo de 30 horas. 8 APARELHAGEM E MATERIAL 8.1 Os equipamentos e a vidraria necessários para a realização dos testes consistem em: Autoclave Incubadora bacteriológica regulada para 35 ( 0,5) ºC Balança de precisão de 0,1 mg Medidor de ph Tubos de ensaio Tubos de Durhan Pipetas tipo Mohr de 10 ml Alças de inoculação de níquel-cromo, platina-irídio ou platina Estante para tubos de ensaio 8.2 Todo material que entre em contato com a amostra deve ser quimicamente inerte, preferencialmente de vidro. 8.3 Todo o material deve ser esterilizado a seco, antes do uso.

4 9 MEIOS DE CULTURA Poderão ser utilizados meios de cultura prontos, encontrados no comércio sob a forma de pó desidratado, ou preparados no laboratório, a partir dos ingredientes básicos que devem ser de alta pureza (p.a.). 9.1 C.L DE CONCENTRAÇÃO DUPLA Pesar e transferir para béquer de 2 L os seguintes sais: 26,0 g do meio desidratado pronto ou pesar 6,0 g de extrato de carne; 10,0 g de peptona; e 10,0 g de lactose. Acrescentar ml de água destilada fria. Aquecer, agitando freqüentemente, até completa dissolução do meio, tomando cuidado para que não seja atingida a temperatura de ebulição. Em tubos de ensaio contendo no seu interior tubo de Duchan invertido, distribuir volumes adequados para que o volume final, após esterilização, seja de 10 ml. Tampar com algodão ou com cápsula de alumínio e esterilizar em autoclave a 121 ºC, durante 15 minutos. ph final, após esterilização: 6,9 ( 0,1) a 25 ºC. 9.2 CLT DE CONCENTRAÇÃO DUPLA Pesar e transferir para béquer de 2 litros os seguintes sais: 71,2 g do meio desidratado pronto ou pesar 40,0 g de triptose; 10,0 g de lactose; 5,5 g de fosfato dibásico de potássio (K 2 HPO 4 ) p.a; 5,5 g de fosfato monobásico de potássio (KH 2 PO 4 ) p.a; 10,0 g de cloreto de sódio (NaCl) p.a; e 0,2 g de lauril sulfato de sódio(c 12 H 25 O 4 SNa) p.a. Acrescentar ml de água destilada fria. Aquecer, agitando freqüentemente, até completa dissolução do meio, tomando cuidado para que não seja atingida a temperatura de ebulição. Em tubos de ensaio contendo no seu interior tubo de Durhan invertido, distribuir volumes adequados para que o volume final, após esterilização, seja de 10 ml. Tampar com algodão ou cápsula de alumínio e esterilizar em autoclave a 121 ºC, durante 15 minutos. ph final, após esterilização: 6,8 ( 0,2) a 25 ºC.

5 9.3 C.L.V.B.B a 2% Pesar e transferir para béquer de 2 L os seguintes sais: 40,0 g do meio desidratado pronto ou pesar 10,0 g de peptona; 10,0 g de lactose; 20,0 g de bile de boi desidratada; e 0,0133 g de corante verde brilhante. Acrescentar ml de água destilada fria. Aquecer, agitando freqüentemente até completa dissolução do meio, tomando cuidado para que não seja atingida a temperatura de ebulição. Em tubos de ensaio contendo no seu interior tubo de Durhan invertido, distribuir volumes adequados para que o volume final, após esterilização, seja de 10 ml. Tampar com algodão ou cápsula de alumínio e esterilizar em autoclave a 121 ºC, durante 15 minutos. ph final, após esterilização: 7,2 ( 0,2) a 25 ºC 10 ENSAIOS 10.1 ENSAIO PRESUNTIVO Preparar os tubos de C.L ou CLT de concentração dupla e dispô-los em séries de 5 tubos em estantes Proceder a marcação dos tubos, anotando os números designados pelo laboratório na ficha de registro de exames Homogeneizar a amostra, agitando vigorosamente o frasco Com uma pipeta esterilizada e obedecendo os cuidados de assepsia, semear 10 ml da amostra em cada um dos 5 tubos de C.L. ou CLT de concentração dupla Após a inoculação de todos os tubos, colocar a estante contendo os tubos inoculados em estufa de cultura bacteriológica a 35 ( 0,5) ºC, durante 24 ( 2) horas Após esse período de incubação, retirar os tubos da incubadora para efetuar a primeira leitura dos resultados. Anotar na ficha de registro de exames quais os tubos que apresentaram resultado positivo, separandoos para a execução do ensaio confirmatório.

6 Retornar à incubadora os tubos com resultados negativos para um período adicional de 24 (± 1) horas a 35 ºC. Após esse novo período, os tubos com gás são anotados e separados para execução do ensaio confirmatório e os negativos são desprezados ENSAIO CONFIRMATÓRIO Marcar os tubos de C.L.V.B.B em número igual ao dos tubos de ensaio presuntivo que apresentaram resultado positivo Agitar cada tubo com resultado positivo e, com alça de inoculação, retirar material e inocular no tubo correspondente de C.L.V.B.B, evitando a película superficial que se forma no ensaio presuntivo positivo Incubar os tubos de C.L.V.B.B inoculados durante 48 ( 3) horas a 35 ( 0,5) ºC, considerando positivos os tubos que, após esse período, apresentarem formação de gás no tubo de Durhan invertido. Anotar o resultado na ficha de registro de exames. 11 RESULTADO A estimativa no NMP de coliformes em 100 ml de amostra (NMP/100 ml) é feita através de consulta direta à tabela a seguir, a partir do número de tubos que apresentou resultado positivo nos dois ensaios. TABELA NÚMERO MAIS PROVÁVEL POR 100 ml DA AMOSTRA LIMITES DE CONFIANÇA EM 95% Nº DE TUBOS NMP/mL Mínimo Máximo POSITIVOS(*) 0 2,2 0 6,0 1 2,2 0,1 12,6 2 5,1 0,5 19,2 3 9,2 1,6 29,4 4 16,0 3,3 52,9 5 16,0 8,0 infinito (*) em cada 5 tubos de 10 ml

7 12. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 12.1 AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Standard methods for the examination of water and wastewater, 16th ed., Washington, D.C., U.S.A. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY. Microbiological methods for monitoring the environment. Water and wastes. EPA 600/ Cincinnati, December, KLABER, P.W.; CLARK. H.F. & GELDREICH, E.E. - Sanitary significance of coliform and fecal coliform organism in surface water. Public Health Reports, 79 (1): 57-60, 1964.