Contagem de coliformes totais e coliformes termotolerantes em alimentos. Prof a Leila Larisa Medeiros Marques

Transcrição

1 Contagem de coliformes totais e coliformes termotolerantes em alimentos Prof a Leila Larisa Medeiros Marques

2 Definição COLIFORMES TOTAIS: grupo de bactérias constituído por bacilos gram-negativos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, não formadores de esporos, oxidase-negativos, capazes de crescer na presença de sais biliares e que fermentam a lactose com produção de aldeído, ácido e gás a 35ºC em horas. O grupo inclui os seguintes gêneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella. COLIFORMES FECAIS OU COLIFORMES TERMOTOLERANTES: são coliformes capazes de se desenvolver e fermentar a lactose com produção de ácido e gás à temperatura de 44,5 ± 0,2 C em 24 horas. O principal componente deste grupo é Escherichia coli, sendo que alguns coliformes do gênero Klebsiella e Citrobacter também apresentam essa capacidade.

3 Definição

4 Coliformes- significado em alimentos Totais: Utilizado para avaliar as condições higiênicas, sendo que altas contagens significam contaminação pósprocessamento, limpezas e sanificações deficientes, tratamento térmicos ineficientes ou multiplicação durante o processamento ou estocagem. Termotolerantes: empregado como indicador de contaminação fecal, ou seja, de condições higiênicosanitárias, visto presumir-se que a população deste grupo é constituída de uma alta proporção de E. coli, que tem seu habitat no trato intestinal do homem e de outro animais. Além de indicar possibilidade de presença de outros patógenos entéricos.

5 Técnicas» Plaqueamento (sólido): aplica-se a amostras de matériasprimas, alimentos e rações, devendo ser utilizada quando o limite máximo tolerado 100 UFC/g ou ml.»nmp (líquido) em alimentos: aplica-se a amostras de matériasprimas e alimentos, devendo ser utilizada quando o limite máximo tolerado for inferior a 100 UFC/g ou ml.»nmp (líquido) em água e gelo: Aplica-se a amostras de água e de gelo usados em estabelecimentos produtores de alimentos. O valor é obtido em NMP/100mL.

6 Pesquisa de coliformes: método em placas. Amostra: açúcar cristal, morango, coxinha, hambúrguer, bolacha recheada e amendoim cru Técnica: Contagem em placas, Plaqueamento em profundidade, plaqueamento sobrecamada ou pour plate

7 Ágar cristal violeta (VRBA) sais biliares e cristal violeta que inibem Gram+; Vermelho neutro (indicador)- revela a fermentação da lactose. Caldo verde brilhante bile 2% lactose Bile bovina e corante verde brilhante que inibem Gram+. Caldo EC Sais biliares inibem Gram+; Mistura de fosfatos impedem a acidificação do meio. Ágar eosina azul de metileno (EMB) Eosina e azul de metileno são corantes inibidores de Gram +. Com a fermentação da lactose e produção de ácido, ocorre precipitação desses corantes que fornecem o brilho verde metálico característico da E. coli.

8 IN 62, 2003 Ler capítulo VI

9 Plaqueamento sobrecamada 15 ml Em posição invertida Prova presuntiva para coliformes totais Selecionar 3 colônias típicas e 3 atípicas para investigar Prova confirmativa para coliformes totais Cada colônia para um caldo verde brilhante Prova confirmativa para coliformes termotolerantes 45C /24 a 48h Para cada tubo positivo no caldo verde brilhante passar para um tubo de caldo EC

10 Colônias em VRBA e Caldo EC Colônias típicas e atípicas

11 Caracterização da E. coli De cada tubo EC positivo

12 Expressão dos resultados R =(C x c x d)/r R = Resultado C = número de colônias contadas c = número de colônias confirmadas r = número de colônias repicadas d = diluição utilizada Atenção!!! Será um cálculo para coliformes totais, outro para coliformes termotolerantes e outro para E. coli!!!! Resultado final= R t (colônias típicas) + R a (colônias atípicas)

13 Exemplo de resultado parcial Diluição 10-2 = 30 colônias contadas, das quais 20 eram típicas e 10 atípicas. Para confirmação de coliformes a 35 C, foram repicadas 5 colônias de cada tipo. Quatro colônias típicas e duas atípicas apresentaram resultado positivo nos testes confirmativos. Aplicando-se a fórmula, teremos para colônias típicas: R T =? Aplicando-se a fórmula, teremos para colônias atípicas: R A =? O resultado final será igual à soma das colônias típicas e atípicas confirmadas: Resultado final = R T + R A =????????????? UFC/g ou ml de coliformes a 35 C..

14 Exemplo de resultado parcial Diluição 10-2 = 30 colônias contadas, das quais 20 eram típicas e 10 atípicas. Para confirmação de coliformes a 35 C, foram repicadas 5 colônias de cada tipo. Quatro colônias típicas e duas atípicas apresentaram resultado positivo nos testes confirmativos. Aplicando-se a fórmula, teremos para colônias típicas: R T = 20 x 4 x 100/5 = Aplicando-se a fórmula, teremos para colônias atípicas: R A = 10 x 2 x 100/5 = 400 O resultado final será igual à soma das colônias típicas e atípicas confirmadas: Resultado final = R T + R A = = 2000 = 2,0 x 10 3 UFC/g ou ml de coliformes a 35 C.

15 Exercício 1. Na placa de VRBA e diluição 10-2 = 20 colônias contadas, das quais 15 eram típicas e 5 atípicas; Para confirmação, foram repicadas 3 colônias de cada tipo para tubos verde brilhante e depois para tubos EC; 2. Todos os tubos de caldo verde brilhante repicados deram positivos para a confirmação de coliformes totais; 3. Para confirmação de coliformes termotolerantes, obtiveram-se dos 3 tubos repicados de colônias típicas, 2 positivos; e das 3 atípicas repicadas, 1 positiva. 4. Na pesquisa de E. coli, dos 3 tubos EC repicados (tanto de típicas quanto atípicas), 1 placa EMB típico deu positivo e 1 atípico positivo para E. coli. Diante destes resultados, pergunta-se: 1. Qual o valor para coliformes a 35 C? 2. Qual o valor para coliformes a 45 C? 3. Qual o valor de E. coli/ml?

16 Pesquisa de coliformes: Número mais provável (NMP) Amostra: leite em pó, leite pasteurizado, água, açúcar refinado, leite fermentado, conserva de vegetais

17 NMP Técnica do número mais provável ou técnica dos tubos múltiplosestimativa da quantidade de MO presentes na amostra; Pelo número de tubos positivos em cada uma das diluições empregada determina-se o Número Mais Provável por grama de produto, tendo como base a tabela estatística de Hoskins para três, cinco ou dez tubos; Por esta técnica pode-se obter informações sobre a população presuntiva de coliformes (teste presuntivo), sobre a população real de coliformes (teste confirmativo) e sobre a população de coliformes de origem fecal (coliformes termotolerantes)

18 NMP a) Teste presuntivo para coliformes totais visa detectar a presença de microrganismos fermentadores de lactose. Meio utilizado: caldo lauril sulfato triptose. Princípio: turvamento e produção de gás, evidenciado pelo tubo de Durham. b) Teste confirmativo para coliformes totais-meio caldo verde brilhante lactose Bile 2%. Princípio: turvamento e produção de gás por bactérias gram negativas, características do grupo coliforme. c)teste confirmativo para coliformes termotolerantesutilização do meio de cultura seletivo Caldo EC e incubação em 44-45ºC. Princípio: turvamento e produção de gás, evidenciado pelo tubo de Durham. c) Teste completo para pesquisa de E. coli - provas bioquímicas.

19 Poder tamponante Inibem Gram+ Inibe Gram+

20 Inibe Gram+

21 IN 62, 2003 Ler capítulo X e grupo da água capítulo IX

22 ml 1 ml 1 ml 1 série em [ ] dupla do meio NMP série 3 tubos (alimentos sólidos) De cada tubo positivo: Para cada EC+, um EMB 2 colônias caract. de cada EMB em tubo de AN

23 NMP série 3 tubos (produtos líquidos) De cada tubo positivo: Para cada EC+, um EMB 2 colônias caract. de cada EMB em tubo de AN De cada tubo AN

24 Exemplo 10-1 Tubos positivos

25 Técnica de esgotamento por estrias

26 Técnica de esgotamento por estrias

27 Em todos os tubos e placas de TODAS as etapas, identificar o número da equipe, o nome da amostra e o mais importante a DILUIÇÃO que está ou a DILUIÇÃO precedente!!!!!

28 Combinação tubos positivos 3:3:1 = 460 UFC/g ou ml, com 95% probabilidade de estar entre 90 e 2000 UFC/g ou ml

29 A tabela a ser consultada deverá ser a que oferece resultados de NMP para inóculos de 0,1, 0,01 e 0,001 g ou ml. OBS: Para obter o NMP/g ou ml, para séries de 3 tubos, com inóculos de 1,0, 0,1 e 0,01 g ou ml, e respectivos intervalos de confiança 95%, dividir por 10 os valores da Tabela 1 correspondente ao arranjo de tubos positivos obtido na análise.

30 NMP- água e gelo Quando o limite de aceitação for <2,0/100mL, usar série de 5 tubos. Quando o limite de aceitação for <1,0/100mL, usar série de 10 tubos.

31 De cada tubo positivo:

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33 De cada tubo positivo:

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35 Padrões microbiólógicos Produto Tolerância para amostra indicativa Coliformes Totais ou a 35 C Tolerância para amostra indicativa Coliformes Termotolerantes ou a 45 C Legislação Técnica a ser utilizada Água para consumo humano Ausência em 100mL Ausência em 100mL Portaria 518, 2004 NMP série de 10 tubos Leite pasteurizado 4NMP/mL 2NMP/mL IN 62, 2011 NMP série de 3 tubos- amostra pura Leite em pó - 10NMP/g RDC 12, 2001 NMP série 3 tubosamostra diluída (10mL na primeira diluição) Açúcar cristal UFC/g RDC 12, 2001 Plaqueamento

36 Fonte: MADIGAN; MARTINKO; PARKER, 2004

37 Testes bioquímicos para coliformes- identificação da E. coli 1. Prova do Indol; 2. Vermelho de metila-vm; 3. Voges-Proskauer-VP; 4. Citrato.

38 Escherichia coli É um indicador de contaminação fecal. A presença de número considerável indica: - Processamento térmico inadequado; - Recontaminação após processamento; - Proliferação microbiana no alimentos que irá permitir a possível multiplicação de MO patogênicos.

39 1. Prova do Indol Triptofano triptofanase Indol + ácido pirúvico + amônia desaminação + p-dimetilaminobenzaldeído +HCl + álcool (reativo de Kovacs) Composto quinoidal (vermelho) CH 2 do anel pirrólico da molécula do indol + o aldeído em meio ácido= quinona

40 2. Vermelho de metila-vm ácido láctico ácido acético Glicose fermentação ácido fórmico ácido mista ácido succínico ácido etílico INDICADOR: Vermelho de metila escala de 4,4 a 6,0. ph 4,4 cor vermelha - prova positiva ph 6,0 cor amarela (acetoína) - prova negativa

41 3. Voges-Proskauer-VP Glicose 2 ác. pirúvico Fermentação butilenoglicol descarboxilação Agente oxidante Acetilmetilcarbinol + -naftol +KOH 40% (acetoína) Catalisador Diacetila Diacetila + núcleo guanidina do -naftol condensação Composto Vermelho OBS.: cor cobre é resultado negativo

42 4. Citrato Citrato citratase ciclo de Krebs ciclo da fermentação do citrato Indicador de ph: azul de bromotimol ph 8,4=coloração azul-da-prússia ph 6,9= coloração verde ph 6,0= coloração amarela ; Citrato piruvato + CO 2 CO 2 + sódio carbonato de sódio ph alto Amônia como fonte de N

43 Resultado das provas bioquímicas da E. coli Resultado das provas bioquímicas demais bactérias